戎　萍，彭　博，張喜蓮，趙　偉，張雪榮，王　偉，張雪竹，馬　融

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，天津　300193；2.天津大學(xué)，天津　300072；3.新疆伊犁州中醫(yī)醫(yī)院兒科，伊犁　835000；4.湖北省中醫(yī)院兒科，武漢　430061）

癲癇是小兒神經(jīng)系統(tǒng)的常見病之一，以反復(fù)癲癇發(fā)作為共同特征的慢性腦部疾病狀態(tài)。癲癇發(fā)作與神經(jīng)元損傷密切相關(guān)。一方面，神經(jīng)細(xì)胞壞死、缺失、結(jié)構(gòu)異常等使腦細(xì)胞維持電位穩(wěn)定的能力下降，一旦有誘發(fā)因素則易引發(fā)癲癇。另一方面，長期或反復(fù)的癲癇活動，可對未成熟大腦的發(fā)育、神經(jīng)元功能、可塑性相關(guān)基因表達(dá)造成長期不良影響[1-2]。細(xì)胞自噬被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，其在癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用正成為研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞自噬的作用具有雙重性，低水平的自噬對細(xì)胞具有保護(hù)作用，過度的自噬可致神經(jīng)元損害。Beclin-1是自噬的正調(diào)節(jié)蛋白，是介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于前自噬小體的關(guān)鍵因子。研究表明反復(fù)驚厥新生大鼠皮質(zhì)Beclin-1水平明顯上調(diào)，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）通過抑制Beclin-1表達(dá)，參與自噬途徑的調(diào)控[3]。B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）能夠減弱Beclin-1與Vps34的相互作用，使其他自噬相關(guān)蛋白難以結(jié)合到自噬體膜上，從而抑制自噬的發(fā)生[4]。課題組前期研究已證實(shí)，以“益腎填精法”為主的茸菖膠囊抗癲癇及改善認(rèn)知損害療效顯著[5]，在保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞方面具有明顯優(yōu)勢[6-7]，其機(jī)制是否與調(diào)控海馬神經(jīng)元自噬過程相關(guān)尚未研究。本研究通過構(gòu)建無鎂誘導(dǎo)的癲癇模型，觀察茸菖膠囊干預(yù)后 6、12、24、72 h 對海馬 Beclin-1、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響，探討其抗癲癇和神經(jīng)保護(hù)作用的自噬調(diào)控機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康成年大耳白家兔30只，雌雄均可，體質(zhì)量2～2.5 kg，購自北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司[合格證號：SCXK（京）2015-0005]。24 h內(nèi)新生SD大鼠50只，購自北京芳元緣養(yǎng)殖場。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑茸菖膠囊（由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，批件號：津藥制字Z20070735）；3-MA（Sigma公司）。5x SDS凝膠加樣緩沖液、顯影液、定影液、胰酶細(xì)胞消化液等購自碧云天生物技術(shù)公司；30%丙烯酰胺Acr/Bic、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷等購自 Ameresco 公司；吐溫、MgCl2·6H2O、NaCl、CaCl2等購自 Sigma公司；PageRuler Prestained Protein Ladder（Thermo scientific）；ECL發(fā)光液（普利萊基因技術(shù)有限責(zé)任公司）、甲醇（國藥集團(tuán)）、麗春紅（碧云天生物技術(shù)研究所）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1腦脊液提取家兔予茸菖膠囊灌胃3 d，每日劑量按生藥為3.64 g/kg，于末次給藥1 h后取腦脊液。耳緣動脈注入空氣處死后，于小腦延髓池穿刺針穿刺成功后，用一次性1 mL注射器吸取600～800 μL清亮腦脊液，放入滅菌后的EP管中，于冰箱-70℃凍存。

2.2原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)取新生SD大鼠海馬，乙醇消毒后斷頭取腦，浸置于冰磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液中，鈍性分離出海馬，剝離腦膜后快速剪成碎塊，用胰蛋白酶消化20 min，加入冰PBS溶液終止消化，加入種植培養(yǎng)液，以每毫升2×105～3×105個的濃度將神經(jīng)元接種于L-多聚賴氨酸包被好的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，之后更換維持培養(yǎng)液。

2.3海馬神經(jīng)元癲癇模型建立參照Sombati等[8]人的癲癇模型制備方法將體外培養(yǎng)至第9天時用無鎂HBSS替代含鎂正常培養(yǎng)基，溫箱中孵育3 h，建立癲癇細(xì)胞模型。繼而將HBSS溶液再次換為含鎂Neurobasal培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒑笮枰娚韺?shí)驗(yàn)鑒定模型建立是否成功。

2.4實(shí)驗(yàn)分組當(dāng)海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第9天時，將其分為下述6組并進(jìn)行相應(yīng)處理。正常組、模型組、3-MA組、5%茸菖膠囊組、10%茸菖膠囊組、20%茸菖膠囊組，分別將原維持液更換為含鎂HBSS、無鎂細(xì)胞外液、無鎂細(xì)胞外液中加入3-MA（5mmol/L）、無鎂外液中加入5%茸菖膠囊、10%茸菖膠囊、20%茸菖膠囊腦脊液，培養(yǎng)3 h后更換為Neurobasal培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、72 h用于實(shí)驗(yàn)。

2.5蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測目標(biāo)蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白并測定蛋白濃度后，將樣品蛋白進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育（內(nèi)參抗體稀釋度為1∶1 000）、二抗孵育（二抗稀釋比例為 1∶10 000）等步驟，ECL 法顯色（暗室操作），凝膠圖像分析系統(tǒng)測定光密度值，用ImageJ 1.43軟件分析灰度值。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時間點(diǎn)比較采用重復(fù)測量方差分析，多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1各組大鼠海馬Beclin-1蛋白表達(dá)比較經(jīng)重復(fù)測量方差分析，各組間海馬Beclin-1蛋白表達(dá)水平總體均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各時間點(diǎn)Beclin-1蛋白表達(dá)水平總體均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），時間和分組不具有交互作用（P＞0.05）。同一組內(nèi)，各時點(diǎn)Beclin-1蛋白比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與同一時點(diǎn)正常組比較，模型組Beclin-1蛋白表達(dá)無顯著變化（P＞0.05）；與同一時點(diǎn)模型組比較，6 h 20%茸菖膠囊組及72 h 5%茸菖膠囊組顯著升高（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1　不同時點(diǎn)各組Beclin-1蛋白電泳圖Fig.1　Electrophoretogram of Beclin-1 protein in each group at different time

表1　各組大鼠海馬Beclin-1蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.1　Comparison of Beclin-1 protein expression in hippocampal neurons of rats in each group（±s）

表1　各組大鼠海馬Beclin-1蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.1　Comparison of Beclin-1 protein expression in hippocampal neurons of rats in each group（±s）

注：與同時點(diǎn)模型組比較，*P＜0.05。

組別正常組模型組3-MA組5%茸菖組10%茸菖組20%茸菖組n　3　3　3　3　3　3處理后6 h　處理后12 h　處理24 h　處理后72 h 1.00±0.00　1.00±0.00　1.00±0.00　1.00±0.00 0.95±0.09　1.25±0.15　1.28±0.07　0.80±0.25 0.87±0.29　1.07±0.50　1.03±0.37　0.69±0.40 1.11±0.22　1.44±0.25　1.48±0.23　1.28±0.14*1.23±0.21　1.40±0.11　1.71±0.54　1.18±0.13 1.28±0.12*　1.61±0.60　1.71±0.74　1.10±0.30

3.2各組大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(dá)比較經(jīng)重復(fù)測量方差分析，各組間海馬Bcl-2蛋白表達(dá)水平總體均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），各時間點(diǎn)Bcl-2蛋白表達(dá)水平總體均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），時間和分組不具有交互作用（P＞0.05）。同一組內(nèi)，各時點(diǎn)Bcl-2蛋白比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與同一時點(diǎn)正常組比較，6 h模型組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與同一時點(diǎn)模型組比較，12 h 20%茸菖膠囊組，24 h 20%茸菖膠囊組，72 h 5%茸菖膠囊組、10%茸菖膠囊組、20%茸菖膠囊組Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）。72 h茸菖膠囊高、中、低三個濃度比較，20%茸菖膠囊組Bcl-2蛋白表達(dá)較5%茸菖膠囊組和10%茸菖膠囊組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），5%茸菖膠囊組與10%茸菖膠囊組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖 2、表 2。

圖2　不同時點(diǎn)各組Bcl-2蛋白電泳圖Fig.2　Electrophoretogram of Bcl-2 protein in each group at different time

表2　各組大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(dá)比較（x±s）Tab.2　Comparison of Bcl-2 protein expression in hippocampal neurons of rats in each group（x±s）

3.3各組大鼠海馬LC3B蛋白表達(dá)比較與同一時點(diǎn)正常組比較，12 h模型組海馬神經(jīng)元LC3B蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。與同一時點(diǎn)模型組比較，12 h 20%茸菖膠囊組LC3B蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。見表 3。

表3　各組大鼠海馬LC3B蛋白表達(dá)比較（x±s）Tab.3　Comparison of LC3B protein expression in hippocampal neurons of rats in each group（x±s）

4　討論

近年來自噬在癲癇發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用逐漸受到認(rèn)識。癲癇發(fā)作會引起氧化應(yīng)激、離子通道異常、谷氨酸神經(jīng)興奮毒性、三磷腺苷耗竭、腫瘤壞死因子-α升高等，在這些情況下都會導(dǎo)致神經(jīng)元自噬的發(fā)生。自噬被過度激活，可致神經(jīng)元死亡，加重海馬損傷及癲癇發(fā)作，并造成學(xué)習(xí)記憶及情感障礙[9-10]。在自噬啟動階段，Beclin-1是自噬的調(diào)控基因，發(fā)揮自噬正調(diào)節(jié)作用。而Bcl-2則能夠抑制自噬的發(fā)生[11]。Beclin-1與Bcl-2作用而調(diào)控自噬與凋亡之間的平衡，自癲癇發(fā)作12～8h Beclin-1蛋白水平開始升高，而Bcl-2蛋白水平自癲癇發(fā)作24～48 h逐漸下降[12]。研究表明，自噬抑制劑能夠通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Bcl-2的表達(dá)，調(diào)控癲癇或驚厥大鼠海馬自噬活性，從而減少海馬神經(jīng)元的損傷，起到抗癲癇及神經(jīng)保護(hù)作用[3，13-14]。

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，癲癇的病機(jī)關(guān)鍵為風(fēng)痰閉阻，多采用熄風(fēng)豁痰開竅法治療。馬融教授認(rèn)為，癲癇發(fā)作對于發(fā)育期的兒童而言，造成的神經(jīng)損害更明顯，且長期反復(fù)的癲癇發(fā)作常導(dǎo)致認(rèn)知障礙的發(fā)生，因此治療小兒癲癇應(yīng)抗癇與益智并舉。根據(jù)小兒“腎常虛”的生理特點(diǎn)及腎與腦的密切關(guān)系，提出小兒癲癇伴認(rèn)知障礙的病機(jī)關(guān)鍵在于“腎精虧虛、風(fēng)痰閉阻”。據(jù)此研制了茸菖膠囊（原名抗癇增智顆粒），重在抗癇與益智并舉。課題組前期研究已證實(shí)，以“益腎填精法”為主的茸菖膠囊抗癲癇及改善認(rèn)知損害療效顯著，在保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞方面具有明顯優(yōu)勢，但這是否與茸菖膠囊調(diào)控受損神經(jīng)元自噬活性有關(guān)尚未研究。本研究結(jié)果顯示：1）茸菖膠囊可影響B(tài)eclin-1蛋白表達(dá)。高濃度茸菖膠囊腦脊液可在短時間內(nèi)促進(jìn)Beclin-1蛋白表達(dá)明顯，低濃度茸菖膠囊腦脊液在維持Beclin-1蛋白表達(dá)作用較優(yōu)。2）茸菖膠囊可促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞自噬，其促進(jìn)作用與給藥濃度相關(guān)。綜上所述，基于益腎填精法的茸菖膠囊可能通過影響B(tài)eclin-1表達(dá)干預(yù)自噬過程，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞自噬，發(fā)揮抗癲癇及保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用。