賀雨馨，曾宇馨，祝天添，朱南南，孫志蓉

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京　102488）

蘭科植物金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）為2015年版中國(guó)藥典中記載的石斛藥材來(lái)源之一，具有養(yǎng)胃生津、滋陰清熱等作用[1]?，F(xiàn)代藥理研究其具有明目、抗疲勞、抗衰老等作用[2]。金釵石斛的化學(xué)成分主要有多糖、生物堿、酚類化合物等[2]，具有良好的保健功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在市場(chǎng)上的需求也在不斷增加。石斛屬為蘭科中最大的屬之一，且石斛屬中的藥用石斛種類多達(dá)50多種[3]，使得在石斛市場(chǎng)中存在著以假充真、以次充好的情況。為保證金釵石斛藥材的質(zhì)量及臨床用藥的安全可靠，建立一種快速簡(jiǎn)便有效的鑒別方法極為重要。

傅里葉紅外光譜法鑒別中藥材是近年發(fā)展起來(lái)的一種中藥材鑒定方法。紅外光譜技術(shù)應(yīng)用于中藥材的鑒別和定性分析具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、用樣量少、不破壞樣品、不消耗化學(xué)試劑、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，且能夠反映藥材的整體特征。有多個(gè)研究[4-7]采用紅外光譜法對(duì)多種中藥材進(jìn)行鑒定和整體分析。隨著傅里葉紅外光譜法在中藥材中的不斷應(yīng)用，有學(xué)者將其應(yīng)用到金釵石斛的研究中，鄧月娥等[8]和李瑩等[9]對(duì)不同產(chǎn)地、不同種的金釵石斛進(jìn)行紅外光譜研究，但其只針對(duì)原藥材進(jìn)行了研究，并未對(duì)其不同提取物進(jìn)行研究。石斛作為藥食兩用的藥材，以其為原料配方的中藥制劑和保健品年需求總量為8 000～10 000 t，且每年以10%～15%的速度遞增[10]，這不僅需要有一個(gè)快捷鑒別金釵石斛藥材的方法，同時(shí)還需要有針對(duì)其不同提取物進(jìn)行快速鑒別的方法。本研究采用傅里葉紅外光譜和二階導(dǎo)數(shù)譜對(duì)金釵石斛不同提取溶劑中化學(xué)成分的整體變化規(guī)律進(jìn)行分析，為金釵石斛的提取方法，有效部位的確定，金釵石斛的整體評(píng)價(jià)和快速鑒別提供一定的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品來(lái)源樣品由北京中醫(yī)藥大學(xué)孫志蓉教授鑒定為蘭科植物金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）的干燥莖（由貴州赤水信天藥業(yè)公司提供）。

1.2儀器與試劑儀器：Spectrum GX FTIR紅外光譜儀（美國(guó)Perkin Elmer），DTGS檢測(cè)器，光譜測(cè)量范圍 400～4 000 cm-1，光譜分辨率為 4 cm-1，掃描次數(shù)為16次，OPD速度為0.2 cm-1/s，掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除水和二氯化碳（CO2）的干擾；變溫附件為50-886型Portable Controller可編程控制單元（Love Control公司），控溫范圍是50～120℃，程序控制，原位等間隔采樣，每隔10℃進(jìn)行1次紅外光譜掃描，升溫速率為2℃/min；METTLER-AE240型1/100 000電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；XMTD-6000儀表恒溫水浴鍋（上海樹(shù)立儀器儀表有限公司）；RJ-LDL-50G低速大容量多管離心機(jī)（無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；ZN-02小型粉碎機(jī)（北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司）。

試劑：溴化鉀（純度為99.9%）、濃硫酸、苯酚、乙醇均為分析純（北京化工廠）；淀粉和油類標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。草酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品由清華大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，購(gòu)自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1藥材粉末的制備金釵石斛藥材進(jìn)行干燥粉碎，過(guò)3號(hào)篩，將藥材粉末用溴化鉀粉末混合充分研磨（藥材與溴化鉀用量之比約為2∶100）壓片。對(duì)壓片進(jìn)行掃描，獲得樣品的紅外譜圖。

1.3.2水提醇沉提取物的制備取本品粉末約0.3 g，精密稱定，加水200 mL，加熱回流2 h，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2 mL，置15 mL離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min）20 min，棄去上清液（必要時(shí)過(guò)濾），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀烘干即得。將烘干粉末進(jìn)行溴化鉀壓片，紅外光譜掃描。

1.3.3無(wú)水乙醇提取物的制備精密稱取樣品2.0 g，置于三角瓶中，加100 mL無(wú)水乙醇，然后將樣品超聲（40 Hz，常溫）10 min，超聲之后進(jìn)行離心（4 500 r/min，20 min），取上清液，濃縮后進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.4數(shù)據(jù)處理紅外圖譜采用Spectrum V6.3.5操作軟件，對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖譜預(yù)處理，預(yù)處理過(guò)程包括基線校正和比對(duì)；二階導(dǎo)數(shù)譜采用Spectrum v6.3操作軟件，13點(diǎn)平滑。

2　結(jié)果與分析

2.1金釵石斛藥材粉末的紅外光譜主體成分解析將金釵石斛藥材粉末、油類和淀粉標(biāo)品一維紅外光譜進(jìn)行對(duì)比，見(jiàn)圖1，金釵石斛主要吸收峰的振動(dòng)方式和峰歸屬見(jiàn)表1。從圖中可以看到，油類標(biāo)品具有 3 個(gè)特征峰（2926cm-1、2854cm-1、1745cm-1），金釵石斛中 2 923 cm-1、2 855 cm-1、1 738 cm-1特征峰與油類這3個(gè)特征峰出峰位置相近，但峰形存在一定的差別。在1 200 cm-1以下，1 159 cm-1、1 106 cm-1、1 076 cm-1、1 035 cm-1，這組峰的位置與形狀與淀粉標(biāo)品 1 155 cm-1、1 081 cm-1、1 019 cm-1位置的階梯峰相似，同時(shí)金釵石斛紅外譜圖中，在950 cm-1以下，還有糖環(huán)骨架振動(dòng)吸收等多個(gè)指紋特征峰。由于藥材譜圖與標(biāo)品譜圖所對(duì)應(yīng)的特征峰較少，初步推測(cè)金釵石斛含有油類和淀粉類成分。

圖1　金釵石斛原藥材（a）油類和（b）淀粉標(biāo)品（c）紅外光譜譜圖Fig.1　FT-IR spectra of Dendrobium(a),oil(b),starch(c),and nobile samples

表1　金釵石斛各吸收峰官能團(tuán)的振動(dòng)方式和主要峰歸屬Tab.1　vibration mode of absorption peak functional and the main peak attributable of Dendrobium nobile

二階導(dǎo)數(shù)譜能夠?qū)⒁痪S紅外光譜的重疊峰分開(kāi)，進(jìn)一步提高譜圖的分辨率，使吸收峰的位置更加準(zhǔn)確。將金釵石斛、油類標(biāo)品一維譜圖進(jìn)行二階求導(dǎo)，得到二階導(dǎo)數(shù)圖譜（圖2）。從圖中可見(jiàn)，3 000～1 600 cm-1波段內(nèi)，油類標(biāo)品在 2 960 cm-1、2 925 cm-1、2 852 cm-1、1 751 cm-1、1 738 cm-1處出現(xiàn)5個(gè)特征峰，而金釵石斛在2 920 cm-1、2 851 cm-1、1 737 cm-1處的吸收峰與油類中2 925 cm-1（亞甲基—CH2伸縮振動(dòng)）、2 852 cm-1（亞甲基—CH2伸縮振動(dòng)）、1 738 cm-1（酯羰基C=O伸縮振動(dòng)）處的吸收峰在二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜上位置接近，相差波數(shù)為5、1、1，并且峰形相似。

圖2　金釵石斛（a）油類（b）二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜譜圖Fig.2　SD-IR spectra of Dendrobium(a)and oil(b)nobile samples

金釵石斛與淀粉標(biāo)品的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖見(jiàn)圖3，在1 800～1 000 cm-1的波段范圍內(nèi)，金釵石斛中1467cm-1、1334cm-1、1202cm-1、1163cm-1、1126cm-1、1 108 cm-1、1 078 cm-1、1 056 cm-1吸收峰與淀粉中1462cm-1、1333cm-1、1206cm-1、1155cm-1、1125cm-1、1 107 cm-1、1 079 cm-1、1 054 cm-1等吸收峰位置相似。同時(shí)在二階導(dǎo)數(shù)譜中，隨著分辨率增高，芳香類成分的指紋特征峰位置更為明顯，發(fā)現(xiàn)金釵石斛的二階導(dǎo)數(shù)光譜有 1 593 cm-1、1 559 cm-1、1 508 cm-1芳香環(huán)骨架伸縮振動(dòng)的吸收峰，還有1 737 cm-1、1 635 cm-1等C=O伸縮振動(dòng)吸收峰。二階導(dǎo)數(shù)譜圖的比對(duì)，再次明確金釵石斛中含有脂類和淀粉類成分，并含有芳香類物質(zhì)。

金釵石斛二階導(dǎo)數(shù)圖譜中在1 318 cm-1附近有強(qiáng)吸收峰，猜測(cè)可能為草酸鈣的吸收峰，為了確定石斛中是否含有草酸鈣成分，進(jìn)一步將金釵石斛原藥材粉末與草酸鈣標(biāo)品的二階導(dǎo)數(shù)譜圖進(jìn)行比對(duì)，見(jiàn)圖4。發(fā)現(xiàn)草酸鈣有2個(gè)特征強(qiáng)峰，1 318 cm-1和782 cm-1，金釵石斛中 1 318 cm-1、763 cm-1吸收峰和草酸鈣中特征強(qiáng)峰在二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜上位置一致，說(shuō)明金釵石斛中都含有草酸鈣成分。

圖3　金釵石斛（a）和淀粉標(biāo)品（b）二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜譜圖Fig.3　SD-IR spectra of Dendrobium(a)and starch(b)nobile samples

圖4　金釵石斛（a）和草酸鈣（b）標(biāo)品二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜譜圖Fig.4　SD-IR spectra of calcium Dendrobium(a)and oxalate(b)nobile samples

2.2金釵石斛水提醇沉提取物的紅外光譜主體成分解析采用中國(guó)藥典中提取金釵石斛多糖的方法提取金釵石斛原藥粉，提取物進(jìn)行紅外光譜掃描，對(duì)比金釵石斛水提醇沉提取物和金釵石斛原藥粉的一維紅外圖譜，見(jiàn)圖5。提取物的出峰位置和原藥材有明顯差異，并且提取物的峰數(shù)明顯少于原藥材，說(shuō)明化學(xué)成分種類減少，提取物和原藥粉具體特征峰的出峰位置見(jiàn)表2。金釵石斛水提醇沉提取物中1 741 cm-1與1 651 cm-1附近的相對(duì)峰強(qiáng)度有明顯變化，提取后1 741 cm-1附近的峰強(qiáng)度接近1 651 cm-1附近的峰強(qiáng)度；糖區(qū)的各個(gè)特征峰強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)，說(shuō)明金釵石斛水提醇沉后粗多糖含量明顯增多，這也說(shuō)明金釵石斛多糖多為水溶性糖；并且出現(xiàn)了1 080 cm-1附近特征峰，說(shuō)明金釵石斛多糖多以糖苷的形式存在。

圖5　金釵石斛水提醇沉提取物（a）和金釵石斛原藥粉（b）紅外光譜圖Fig.5　FT-IR spectra of the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a)and Dendrobium nobile samples(b)

金釵石斛水提醇沉提取物和原藥材粉末二階導(dǎo)數(shù)譜圖，見(jiàn)圖6，可見(jiàn)特征峰的差異更加明顯，具體的出峰位置見(jiàn)表3。金釵石斛水提醇沉提取物在1 800～1 000 cm-1波段范圍內(nèi)，共有2個(gè)強(qiáng)峰，1 158 cm-1和1 079 cm-1，其中1 079 cm-1是最強(qiáng)峰，中強(qiáng)峰2個(gè)分別為1 747 cm-1和1 020 cm-1，弱峰若干；金釵石斛原藥粉有2個(gè)強(qiáng)峰，1 467 cm-1和1 163 cm-1，其中1 163 cm-1為最強(qiáng)峰，中強(qiáng)峰8個(gè)分別為 1 737 cm-1、1 593 cm-1、1 508 cm-1、1 421 cm-1、1 376 cm-1、1 126 cm-1、1 078 cm-1和 1 056 cm-1，弱峰若干，并且在該波段內(nèi)峰形、峰位置、峰強(qiáng)度都有顯著差異。1 600～1 300 cm-1波段內(nèi)，提取物出峰數(shù)量明顯減少且峰強(qiáng)較原藥材小，說(shuō)明提取物中芳香類成分含量減少。

圖6　金釵石斛水提醇沉提取物（a）和金釵石斛原藥粉（b）二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖Fig.6　SD-IR spectra of the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a)and Dendrobium nobile samples(b)

金釵石斛水提醇沉提取物與淀粉標(biāo)品的一維紅外光譜譜圖見(jiàn)圖7。金釵石斛提取物峰1156cm-1，1080cm-1，1022cm-1與淀粉標(biāo)準(zhǔn)譜圖參考峰 1155cm-1、1081cm-1、1019cm-1相似，兩者的相差波數(shù)為 1、1、3，且金釵石斛提取物紅外光譜形狀與淀粉標(biāo)品譜圖相似，因此可以推斷金釵石斛多糖多為淀粉成分。具體出峰情況見(jiàn)表4。并且把金釵石斛水提醇沉提取物和淀粉標(biāo)品進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析，取糖區(qū)1 200～1 000 cm-1波段，把金釵石斛水提醇沉提取物和淀粉標(biāo)品譜圖進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析，金釵石斛與淀粉標(biāo)品的相關(guān)系數(shù)為0.945。

表2　金釵石斛水提醇沉提取物和金釵石斛原藥粉特征峰的出峰位置Tab.2　Position of characteristic peaks of Dendrobium nobile samples and the water extraction and alcohol precipitation extract samples cm-1

表3　金釵石斛水提醇沉提取物和金釵石斛原藥粉二階導(dǎo)數(shù)特征峰的出峰位置Tab.3　Position of the second derivatine characteristic peaks of dendrobium nobile somples and the water extraction alcohol precipitation extract samples cm-1

圖7　金釵石斛水提醇沉提取物（a）和淀粉標(biāo)品（b）紅外光譜圖Fig.7　FT-IR spectra of starch(b)and the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a)

由金釵石斛水提醇沉提取物及淀粉標(biāo)品紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)可見(jiàn)，金釵石斛與淀粉標(biāo)品重疊峰更多，且峰形也更為接近，尤其在1 000～1 200 cm-1波段內(nèi)，金釵石斛峰 1 158 cm-1、1 104 cm-1、1 079 cm-1、1 056 cm-1、1 020 cm-1與淀粉峰 1 155 cm-1、1 125 cm-1，1 107 cm-1、1 079 cm-1、1 054 cm-1，1 019 cm-1位置非常相似，再一次證明金釵石斛水提醇沉提取物多為淀粉成分，見(jiàn)圖8。具體的出峰位置見(jiàn)表5。通過(guò)以上分析可知金釵石斛水提醇沉提取物大部分是淀粉成分。

2.3金釵石斛無(wú)水乙醇提取物的紅外光譜主體成分解析將金釵石斛無(wú)水乙醇提取物進(jìn)行紅外光譜掃描，并將無(wú)水乙醇提取物、水提醇沉提取物以及原藥材粉末的一維紅外圖譜進(jìn)行比對(duì)，見(jiàn)圖9。無(wú)水乙醇提取物在2 925 cm-1、2 853 cm-1位置峰強(qiáng)明顯高于原藥材在2 923 cm-1、2 855 cm-1處的峰強(qiáng)，可以認(rèn)為無(wú)水乙醇提取物中脂肪類成分含量高于原藥材。而無(wú)水乙醇提取物在1 200～1 000 cm-1糖區(qū)段內(nèi)出峰數(shù)量明顯少于水提醇沉提取物，說(shuō)明無(wú)水乙醇提取物中多糖含量較少。具體的特征峰出峰位置見(jiàn)表6。

圖8　金釵石斛水提醇沉提取物（a）和淀粉（b）標(biāo)品的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖Fig.8　SD-IR spectra of starch(b)and the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a)

將金釵石斛無(wú)水乙醇提取物與油類標(biāo)準(zhǔn)品一維紅外譜圖進(jìn)行比對(duì)，見(jiàn)圖10，具體出峰位置見(jiàn)表7。金釵石斛無(wú)水乙醇提取物在2 925 cm-1、2 853 cm-1、1 735 cm-1、1 462 cm-1位置處出峰。石斛藥材無(wú)水乙醇提取物中的特征峰與脂肪類成分參考峰越接近，且能對(duì)應(yīng)的峰個(gè)數(shù)越多，則該藥材中脂類含量越高，因此，金釵石斛無(wú)水乙醇提取物中脂類成分含量相對(duì)大。

表4　金釵石斛水提醇沉提取物以及淀粉標(biāo)品特征峰的出峰位置Tab.4　Position of characteristic peaks of starch and the water extraction and alcohol precipitation extract samples cm-1

表5　金釵石斛藥材水提醇沉提取物與淀粉標(biāo)品二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜特征峰的出峰位置Tab.5　Position of SD-IR character peaks of Dendrobium nobile water extract alcohol precipitation sample and the starch cm-1

圖9　金釵無(wú)水乙醇提取物（a）、水提醇沉提取物（b）和原藥材（c）紅外光譜圖Fig.9　FT-IR spectra of the anhydrous ethanol extract samples(a)the water extraction and alcohol precipitation extract samples(b)and Dendrobium nobile samples(c)

圖10　金釵石斛無(wú)水乙醇提取物（a）和油類（b）紅外光譜圖Fig.10　FT-IR spectra of oil(a)and the anhydrous ethanol extract samples(b)

3　討論與結(jié)論

從金釵石斛原藥材和不同提取物的一維紅外光譜分析可知，原藥材和提取物含有相似的特征峰，如2 920 cm-1（亞甲基—CH2伸縮振動(dòng)）、1 737 cm-1（酯羰基C=O伸縮振動(dòng)）附近的特征峰、1000～1200cm-1（C-O伸縮振動(dòng)）波段內(nèi)的特征峰，可以初步判定金釵石斛中有多糖、脂類、芳香類化合物，并且通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)確定有淀粉類和油類物質(zhì)。一維紅外圖譜在一定程度上存在著重疊峰，致使一些特征峰被隱藏，而二階導(dǎo)數(shù)譜可以使隱藏峰顯露，對(duì)于整體結(jié)構(gòu)解析更為完整。通過(guò)二階導(dǎo)數(shù)譜進(jìn)一步佐證了以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)在原藥材的二階導(dǎo)數(shù)譜中，可以觀察到1 318 cm-1和763 cm-1的吸收峰，該吸收峰分別為草酸根負(fù)離子中C-O鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)，表明金釵石斛具有草酸鈣的特征峰，而草酸鈣是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛分布于植物細(xì)胞中，這樣的變化說(shuō)明二階導(dǎo)數(shù)譜相較于一維譜圖更全面。不同提取方式所提取的物質(zhì)含量存在極大的差別，通過(guò)特征峰峰強(qiáng)可以簡(jiǎn)單快捷地判斷某種物質(zhì)的含量。水提醇沉提取物紅外譜圖證明了金釵石斛中含有大量的水溶性多糖，且主要以淀粉形式存在。而無(wú)水乙醇提取物的譜圖則證明了金釵石斛中脂類相對(duì)含量較大，完美體現(xiàn)了“相似相溶”的原則。

金釵石斛現(xiàn)不僅作為藥典記載的石斛藥材來(lái)源之一，同時(shí)也是藥食同源的藥材，更是保健品市場(chǎng)研究的熱點(diǎn)，故市場(chǎng)中金釵石斛摻假的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，目前市場(chǎng)中把蘭科金石斛屬、石仙桃屬和石豆蘭屬數(shù)十種植物也作為中藥石斛混入商品流通及藥用石斛混種混收等現(xiàn)象依然存在。出現(xiàn)這些問(wèn)題的主要原因在于藥用石斛鑒定方法不夠完善，鑒定指標(biāo)不夠明確。本實(shí)驗(yàn)采用紅外光譜法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)分析技術(shù)獲得金釵石斛的整體結(jié)構(gòu)信息，為今后系統(tǒng)完整的石斛鑒定研究打下了基礎(chǔ)，也為基原相近、易混淆的中藥鑒別提供了一個(gè)可發(fā)展的方向，同時(shí)為中藥材不同提取物的鑒別提供了思路。

表6　金釵石斛無(wú)水乙醇提取物、水提醇沉提取物和原藥材紅外圖譜特征峰的出峰位置Tab.6　Positions of FT-IR character peaks of the anhydrous ethanol extract samples,the water extraction and alcohol precipitation extract samples and Dendrobium nobile samples cm-1

表7　金釵石斛無(wú)水乙醇提取物和油類標(biāo)品紅外圖譜特征峰的出峰位置Tab.7　Positions of character peaks of oil and the anhydrous ethanol extract samples cm-1

紅外光譜與二階導(dǎo)數(shù)譜圖的結(jié)合，能夠?qū)疴O石斛進(jìn)行整體分析，并且通過(guò)對(duì)不同提取譜圖的研究，能觀察到金釵石斛中化學(xué)成分的整體變化，有助于對(duì)藥材進(jìn)行整體的質(zhì)量控制和鑒別，并且本實(shí)驗(yàn)在對(duì)原藥材進(jìn)行研究同時(shí)，增加了對(duì)不同提取物的研究，使得整體分析更為全面。本研究結(jié)果證明紅外光譜整體結(jié)構(gòu)解析與鑒定方法用于石斛這類價(jià)格昂貴、資源獲得困難的中藥材非常適合，其應(yīng)用對(duì)于實(shí)現(xiàn)石斛藥材快速鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制具有非常重要的意義。