楊星雅 田野 馮葆欣 李鵬飛 房國(guó)梁 李良 于濤

1國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所（北京100061）

2國(guó)家體育總局體育文化發(fā)展中心

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，主要存在著兩種脂肪組織：白色脂肪組織（White adipose tissue，WAT）和棕色脂肪組織（Brown adipose tissue，BAT），共同維持機(jī)體能量代謝平衡。WAT是一種儲(chǔ)能組織，以甘油三酯的形式儲(chǔ)存能量。而BAT是一種耗能組織，可以通過產(chǎn)熱的方式將能量消耗。一直以來，BAT在成人體內(nèi)被認(rèn)為是低功能的，而且由于數(shù)量少和分布局限，對(duì)人體代謝的作用是微不足道的[1]。但是近些年來的研究證明，在成人體內(nèi)也存在著具有活性的棕色脂肪組織[2-4]，因此棕色脂肪組織可能對(duì)飲食導(dǎo)致的肥胖、胰島素抵抗以及2型糖尿病等起到重要的預(yù)防作用。

BAT是一個(gè)強(qiáng)產(chǎn)熱器官，其產(chǎn)熱能力是肝臟的數(shù)十倍，也是肌肉的數(shù)倍[5]，它具有很強(qiáng)的適應(yīng)外部刺激的能力，并通過非顫栗性產(chǎn)熱的形式釋放熱量。刺激其產(chǎn)熱的因素包括寒冷、交感神經(jīng)及細(xì)胞分泌因子等[6，7]。產(chǎn)熱機(jī)制主要是通過其線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白 1（uncoupling protein 1，UCP1），將脂肪酸氧化和ATP產(chǎn)生解耦連，使能量以熱量形式散失，所以，UCP1是反映其產(chǎn)熱能力的重要指標(biāo)。PR結(jié)構(gòu)域家族第16個(gè)成員（PR-domain-containing 16，PRDM16）是一種鋅指蛋白，在棕色脂肪組織分化過程中起著正向調(diào)控作用，能促進(jìn)棕色脂肪組織的形成，在棕色-白色脂肪組織形成過程中起“開關(guān)”的作用，即它可以促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞中一些活性蛋白的特異性基因表達(dá)，并抑制白色脂肪細(xì)胞中一些活性蛋白的特異性基因表達(dá)[8]。過氧化物酶體增殖活化受體γ輔激活因子-1α（PPAR gamma coactivator-1α，PGC-1α）作為轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子參與包括調(diào)節(jié)棕色脂肪組織產(chǎn)熱等調(diào)控能量代謝相關(guān)的多種功能[9]，并可與PRDM16相互作用而促進(jìn)線粒體生成和適應(yīng)性產(chǎn)熱基因的表達(dá)[10]。

運(yùn)動(dòng)作為科學(xué)有效的減肥方法，對(duì)BAT有著怎樣的影響吸引了很多研究人員的興趣。早在上世紀(jì)末就有學(xué)者對(duì)運(yùn)動(dòng)對(duì)棕色脂肪組織功能的影響開展了研究，但是研究結(jié)果并不一致。有研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)可以增加BAT前體細(xì)胞的募集，使UCP1表達(dá)增加，增強(qiáng)棕色脂肪組織的產(chǎn)熱作用[11，12]；也有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的跑臺(tái)訓(xùn)練可以顯著降低大鼠棕色脂肪組織含量和UCP1的表達(dá)水平[13-15]；另外，還有學(xué)者認(rèn)為，8周或9周的遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)大鼠棕色脂肪組織細(xì)胞UCP1 mRNA的表達(dá)水平無明顯影響[16，17]。以上這些研究中，運(yùn)動(dòng)方案基本都是有氧運(yùn)動(dòng)，對(duì)于其他運(yùn)動(dòng)方式，如抗阻訓(xùn)練對(duì)棕色脂肪組織會(huì)產(chǎn)生怎樣影響的研究較少，尤其在國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。2012年有研究顯示，抗阻運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)PGC-1α的亞型顯著升高[18]，而PGC-1α可以促進(jìn)棕色脂肪組織的活性，所以本研究主要從不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)棕色脂肪組織的影響這一點(diǎn)切入，建立大鼠的抗阻訓(xùn)練模型，對(duì)爬梯法抗阻訓(xùn)練以及跑臺(tái)有氧訓(xùn)練對(duì)大鼠棕色脂肪組織的形態(tài)及活性的影響進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物類型

6周齡雄性SD大鼠（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別是安靜對(duì)照組（C組）、有氧訓(xùn)練組（T組）和抗阻訓(xùn)練組（L組）。自由飲水進(jìn)食，光照比為12 h∶12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后稱重，開始進(jìn)行為期8周的訓(xùn)練。

1.2 訓(xùn)練方案

1.2.1 抗阻訓(xùn)練方案（負(fù)重爬梯法）[[1919--2222]]

爬梯1.1×0.18 m，80°傾斜放置，頂部有一個(gè)小籠子供大鼠休息，負(fù)重裝置固定于大鼠尾部。適應(yīng)性訓(xùn)練：共3天，每天不加負(fù)荷讓大鼠完成爬梯8次。正式訓(xùn)練：每輪訓(xùn)練包含4～8次的遞增負(fù)荷爬梯訓(xùn)練。初始負(fù)荷為大鼠體重的50%，然后每次遞增負(fù)荷30 g，直到大鼠成功爬梯8次或爬梯失敗后停止本次訓(xùn)練，大鼠能夠成功完成爬梯的最大負(fù)荷認(rèn)為是本輪訓(xùn)練的最大負(fù)荷。下輪的訓(xùn)練開始先進(jìn)行4次爬梯，負(fù)荷分別為前次最大負(fù)荷的50%、75%、90%和100%，如果大鼠能夠完成這4次訓(xùn)練，在隨后的爬梯訓(xùn)練中，每次遞增負(fù)荷30 g，直到大鼠完成8次爬梯訓(xùn)練或爬梯失敗后停止訓(xùn)練，同樣以成功完成爬梯的最大負(fù)荷作為新的最大負(fù)荷，依次類推。同一只大鼠兩次爬梯之間休息2 min?？棺栌?xùn)練每3天進(jìn)行1次，每只大鼠每次訓(xùn)練時(shí)間約為10～20 min，共進(jìn)行8周。

1.2.2 有氧訓(xùn)練方案（跑臺(tái)法）[[2222--2424]]

適應(yīng)性訓(xùn)練：大鼠先進(jìn)行1周的適應(yīng)性訓(xùn)練，以減少正式訓(xùn)練時(shí)的壓力，速度為10 m/min，每天訓(xùn)練10 min，連續(xù)適應(yīng)訓(xùn)練5天。正式訓(xùn)練：第1周速度為15 m/min，訓(xùn)練20 min；然后在8周時(shí)間里，訓(xùn)練速度增至28 m/min，訓(xùn)練時(shí)間增至60 min；整個(gè)訓(xùn)練過程跑臺(tái)坡度均為0°；每周一至周五訓(xùn)練，休息2天。

1.2.3 取材

選取各組中訓(xùn)練情況較好的8只大鼠，在最后一次訓(xùn)練結(jié)束48 h后將大鼠稱重，10%的水合氯醛溶液腹腔麻醉，取肩胛下棕色脂肪組織，稱重并記錄后做好標(biāo)記，取出一部分放入多聚甲醛中固定，其他組織立即放入液氮中迅速冷凍，然后放－80℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)分析

1.3.1 形態(tài)學(xué)研究

取用多聚甲醛固定的組織，石蠟包埋切片，經(jīng)HE染色，光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查，用imageJ軟件對(duì)脂滴面積進(jìn)行計(jì)算，在一個(gè)視野內(nèi)取十個(gè)完整脂滴計(jì)算其平均面積。

1.3.2 熒光定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)

取適量組織，放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，按照動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（天根）說明提取總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找的相關(guān)基因的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），進(jìn)行SYBR GREEN法熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)（Takara）。最后根據(jù)各反應(yīng)孔的Ct值，用相對(duì)定量法算出各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因的引物序列

1.3.3 WWestern bblloott實(shí)驗(yàn)

預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑。在蛋白抽提開始前加入0.1 M PMSF母液，PMSF終濃度1 mM。稱取適量組織，以裂解液體積=1∶9比例加入裂解液，電動(dòng)組織勻漿器15000 rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行勻漿，每次10 s，間隔10 s，進(jìn)行3次勻漿。勻漿時(shí)EP管需要浸入冰水混合物中進(jìn)行降溫。勻漿完成后在冰上孵育20 min，4℃離心，13000 rpm，20 min。離心完成后取上清，在上清液中加入5×的蛋白上樣緩沖液，放入煮沸10 min。SDS-PAGE電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，3%BSA-TBST封閉30 min，然后將膜與稀釋好的一抗4℃孵育過夜（以β-tubulin作為內(nèi)參。一抗均購(gòu)自abcam公司，UCP1、PRDM16和PGC-1α抗體貨號(hào)分別為ab10983、ab106410和ab54481，均為兔多克隆抗體，稀釋倍數(shù)分別為1∶4000、1∶1000和1∶4000，內(nèi)參抗體β-tubulin鼠單抗購(gòu)自Immunoway公司，貨號(hào)為YM3030，稀釋倍數(shù)為1∶5000），次日TBST洗膜3次，每次5 min，洗去未結(jié)合的一抗，加二抗室溫孵育1 h（二抗為山羊抗兔IgG，購(gòu)自天德悅公司，稀釋倍數(shù)為1∶10000），然后TBST洗膜6次，每次3 min，以洗去未結(jié)合的二抗，最后ECL加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光：10 s～5 min（曝光時(shí)間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整），顯影2 min，定影，使用ImageJ軟件獲取條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各指標(biāo)數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，三組間比較用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，取P＜0.05作為有顯著性差異判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠體重的影響

訓(xùn)練前和訓(xùn)練后分別將大鼠稱重，訓(xùn)練前三組大鼠的平均體重分別是：337.4±13.53 g，342.3±14.43 g，345.5±14.98 g，組間無顯著性差異。將訓(xùn)練后體重減去訓(xùn)練前體重得出每只大鼠在8周時(shí)間里的體重增加量，對(duì)照組、有氧訓(xùn)練組和抗阻訓(xùn)練組的平均體重增加量分別是201±72 g，105±41 g和140±39 g，有氧訓(xùn)練后大鼠體重增量?jī)H是對(duì)照組的52%，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異（P＜0.01），抗阻訓(xùn)練后大鼠體重增量為對(duì)照組的70%（P＜0.05）。（圖1）

2.2 兩種運(yùn)動(dòng)對(duì)棕色脂肪組織重量的影響

訓(xùn)練后取肩胛下棕色脂肪組織稱重，對(duì)照組、有氧訓(xùn)練組和抗阻訓(xùn)練組的脂肪組織重量分別是：0.39±0.14 g、0.28 ± 0.08 g、0.33 ± 0.10 g。兩個(gè)訓(xùn)練組分別與對(duì)照組相比較均無顯著性差異。

2.3 兩種運(yùn)動(dòng)對(duì)棕色脂肪組織形態(tài)的影響

有氧訓(xùn)練后BAT的脂滴面積（158 ±52 μm2）與對(duì)照組（354±96 μm2）相比明顯變小，且具有顯著性差異（P＜0.01）；抗阻運(yùn)動(dòng)后脂滴面積（272 ±86 μm2）與對(duì)照組相比有所降低，但無顯著性差異（P＞0.05）。（圖2）

圖1 各組大鼠體重增長(zhǎng)量比較

圖2 各組大鼠BAT脂滴面積比較

2.4 兩種運(yùn)動(dòng)對(duì)BATBAT相關(guān)基因mRNAmRNA水平的影響

有氧訓(xùn)練后PRDM16的mRNA水平是對(duì)照組的1.78倍，并有顯著性差異（P＜0.05），而抗阻訓(xùn)練后是對(duì)照組的1.30倍，無顯著性差異；有氧訓(xùn)練后PGC-1α的mRNA水平是對(duì)照組的2.24倍（P＜0.05），抗阻訓(xùn)練后是對(duì)照組的1.25倍（P＞0.05）；有氧訓(xùn)練和抗阻訓(xùn)練后UCP1的mRNA水平分別是對(duì)照組的1.33倍和1.21倍，二者均無顯著性差異。有氧訓(xùn)練后BAT相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量有比較明顯的升高，且高于抗阻訓(xùn)練。（圖3）

圖3 各組大鼠PRDM16、PGC-1α和UCP1 mRNA水平比較

2.5 兩種運(yùn)動(dòng)對(duì)BAT相關(guān)蛋白水平的影響

有氧訓(xùn)練和抗阻訓(xùn)練后PRDM16蛋白的表達(dá)分別是對(duì)照組的1.46倍（P＜0.05）和1.08倍（P＞0.05），PGC-1α蛋白的表達(dá)量分別是對(duì)照組的1.56倍（P＜0.05）和0.94倍（P＞0.05），UCP1蛋白的表達(dá)量分別是對(duì)照組的和1.20倍（P＞0.05）和1.02倍（P＞0.05），結(jié)果顯示有氧訓(xùn)練后PRDM16和PGC-1α蛋白顯著上升，而UCP1蛋白有所上升，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而抗阻訓(xùn)練后三種蛋白均無顯著性差異。（圖4）

圖4 各組大鼠PRDM16、PGC-1α和UCP1蛋白表達(dá)比較

3 討論

本研究對(duì)不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠BAT的形態(tài)和活性的影響進(jìn)行了初步探索，除了對(duì)目前有文獻(xiàn)報(bào)道的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)棕色脂肪的作用進(jìn)行了驗(yàn)證之外，對(duì)抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)棕色脂肪組織的影響進(jìn)行了研究，并得出了初步的結(jié)論。

3.1 有氧運(yùn)動(dòng)和抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)BATBAT的組織形態(tài)的影響

BAT主要由棕色脂肪細(xì)胞和細(xì)胞周圍豐富的毛細(xì)血管和神經(jīng)構(gòu)成，含有大量的線粒體。其細(xì)胞形態(tài)與WAT僅含一個(gè)大脂滴并填充大部分胞質(zhì)不同，BAT細(xì)胞含有多個(gè)脂滴，并且胞質(zhì)內(nèi)含有很多細(xì)胞器[25]。De Matteis[11]的研究表明，6周的有氧運(yùn)動(dòng)可極顯著地減小BAT的脂滴面積。本研究中，有氧運(yùn)動(dòng)后BAT的脂滴面積也有顯著減小，與前人研究結(jié)果較為一致。而抗阻運(yùn)動(dòng)后脂滴面積減小不明顯。

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)和抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)BATBAT的分化形成的影響

研究證明，經(jīng)典BAT內(nèi)細(xì)胞的起源與WAT細(xì)胞的起源并不相同，反而是與肌細(xì)胞的起源相同[26]。Seale等[8]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRDM16是BAT和骨骼肌之間相互轉(zhuǎn)化的“開關(guān)”，而且PRDM16還可以促進(jìn)一些活性蛋白，如PPARγ、Cidea等在BAT中的高表達(dá)，抑制WAT相關(guān)活性蛋白如抵抗素（resisitin）等的表達(dá)[27，28]。另外，Uldry等[29]研究發(fā)現(xiàn)PRDM16基因的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)線粒體的生物合成和解偶聯(lián)呼吸作用。所以，PRDM16在BAT細(xì)胞的發(fā)育過程中起著正向調(diào)控作用。

Xu等[12，33]的研究中，8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（15 m/min，40 min/天，1周訓(xùn)練5天）可以使BAT中的脂肪前體細(xì)胞顯著增加，分化正調(diào)控因子PRDM16顯著升高，證明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)棕色脂肪細(xì)胞的分化形成有促進(jìn)作用，這與本研究中結(jié)果較一致。而抗阻訓(xùn)練之后，PRDM16的基因水平和蛋白水平都有一定程度的升高，但不具有顯著性差異。這表明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)棕色脂肪組織分化過程中的正調(diào)控因子有明顯的促進(jìn)作用，而抗阻運(yùn)動(dòng)的影響較小。

3.3 有氧運(yùn)動(dòng)和抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)BATBAT活性的影響

BAT的活性主要分兩個(gè)方面——代謝活性和產(chǎn)熱活性。脂肪組織本身作為一種分泌器官，在機(jī)體代謝中起著重要作用，PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄輔激活物，控制著氧化代謝相關(guān)基因的表達(dá)和線粒體的生物合成，并通過對(duì)解偶聯(lián)蛋白的誘導(dǎo)和核呼吸因素的調(diào)節(jié)而影響氧化呼吸的作用，對(duì)BAT的代謝活性有著重要的調(diào)控作用，還可協(xié)同UCP1發(fā)生產(chǎn)熱作用[30]；UCP1則與BAT的產(chǎn)熱活性密切相關(guān)，UCP1在線粒體氧化呼吸的電子傳遞和三磷酸腺苷產(chǎn)生的過程中起解偶聯(lián)作用，使脂質(zhì)氧化產(chǎn)生大量能量以熱能形式經(jīng)血管輸送到身體各個(gè)部位散發(fā)出去[31，32]，從而增加機(jī)體的總能量消耗。

研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于安靜對(duì)照組，8周跑臺(tái)訓(xùn)練（15 m/min，40 min/天，1周訓(xùn)練5天）可以使BAT相關(guān)基因UCP1、PGC-1α等顯著升高[12，33]，De Matteis[11]的研究發(fā)現(xiàn)，6周跑臺(tái)訓(xùn)練（5次/周，60 min/次，速度18 m/min）可以使BAT中PGC-1α顯著升高，而未影響UCP1的表達(dá)，這與本研究的結(jié)果比較一致。而抗阻訓(xùn)練之后，PGC-1α和UCP1的mRNA和蛋白水平都未出現(xiàn)顯著性升高，這表明了有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)棕色脂肪組織的代謝功能有明顯的促進(jìn)作用，并且對(duì)產(chǎn)熱作用影響較小，而抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)BAT的代謝以及產(chǎn)熱活性的影響都比較小。

本研究中的抗阻訓(xùn)練方案是參考其他領(lǐng)域研究所確定的，所以本研究中抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)BAT作用的研究結(jié)果存在著一定的局限性，僅僅是作為初步的探索，將來需對(duì)不同的運(yùn)動(dòng)方案進(jìn)行探索，可能會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果。

4 結(jié)論

8周的有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)BAT的組織形態(tài)、形成和代謝活性有顯著的促進(jìn)作用，對(duì)產(chǎn)熱活性的促進(jìn)作用較??；而8周的抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)BAT無顯著影響。