王平Chun-Guang LI崔迪 邱守濤 漆正堂 李婭暉 丁樹哲

1杭州師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（杭州 311121）

2 National Institute of Complementary Medicine，Western Sydney University

3華東師范大學(xué)青少年健康評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

4上海交通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

骨骼肌占機(jī)體總重的40%～50%，是一種高度可塑性組織，運(yùn)動(dòng)刺激可使肌肉發(fā)生形態(tài)學(xué)和生理生化功能方面的適應(yīng)性顯型變化[1]。已有研究報(bào)道，耐力運(yùn)動(dòng)可明顯增加老年大鼠腓腸肌總超氧化物歧化酶（TSOD）和銅鋅SOD（CuznSOD）的活性，同時(shí)增強(qiáng)腓腸肌線粒體錳SOD（MnSOD）的活性[2]。耐力運(yùn)動(dòng)明顯增加3月齡大鼠股外側(cè)深肌、股外側(cè)淺肌和跖肌MnSOD的活性和股外側(cè)淺肌的CuznSOD活性[3]。一次性力竭運(yùn)動(dòng)明顯增加大鼠股外側(cè)深肌MnSOD mRNA的表達(dá)，同時(shí)增加股外側(cè)淺肌MnSOD蛋白含量，股外側(cè)深肌和股外側(cè)淺肌CuznSOD蛋白含量[4]。故運(yùn)動(dòng)使骨骼肌抗氧化防御功能的積極適應(yīng)是維持骨骼肌健康乃至整個(gè)機(jī)體健康的重要前提和基礎(chǔ)，但運(yùn)動(dòng)性骨骼肌有益適應(yīng)的潛在分子機(jī)制還不是很清楚。

有研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與骨骼肌氧化損傷等應(yīng)激反應(yīng)[5]。Dobrowolny等[6]為了證實(shí)自噬與骨骼肌抗氧化防御功能之間的關(guān)系，建立了CuznSOD基因突變小鼠模型，結(jié)果證實(shí)自噬與抗氧化防御功能之間關(guān)系密切。運(yùn)動(dòng)可適度激活自噬，它可將骨骼肌細(xì)胞內(nèi)部分細(xì)胞器、蛋白質(zhì)形成分隔膜包繞，形成自噬體，然后通過(guò)細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)運(yùn)輸至溶酶體消化降解，并有效清除骨骼肌收縮過(guò)程中產(chǎn)生的有害的活性氧，從而維持骨骼肌細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)[7]。

目前而言，運(yùn)動(dòng)性自噬在骨骼肌氧化應(yīng)激過(guò)程中是否必須，運(yùn)動(dòng)、自噬和骨骼肌抗氧化防御功能之間潛在的分子機(jī)制還不是很清楚。本研究建立一次性力竭運(yùn)動(dòng)小鼠模型，通過(guò)檢測(cè)骨骼肌自噬相關(guān)因子Beclin1、P62、Bcl2的表達(dá)變化和T-SOD、CuznSOD、MnSOD活性和T-AOC的含量變化，及P62的蛋白表達(dá)與骨骼肌TAOC含量和CuznSOD活性之間的相關(guān)性分析，探討運(yùn)動(dòng)能否激活自噬和運(yùn)動(dòng)性自噬與骨骼肌抗氧化防御功能之間發(fā)生交互作用的控制節(jié)點(diǎn)。預(yù)期成果將進(jìn)一步闡明運(yùn)動(dòng)性自噬是維持骨骼肌氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的一條重要調(diào)控路徑，增進(jìn)對(duì)骨骼肌顯型適應(yīng)調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，還有可能為鞏固和優(yōu)化骨骼肌質(zhì)量及其功能的分子機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

4周齡清潔級(jí)健康雄性ICR（Institute for Cancer Research）小鼠30只，體重25.17± 2.46 g，購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK（滬）2007-0005，使用許可證：SYXK（滬）2004-0001。小鼠常規(guī)分籠（5只/籠），國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料（上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）飼養(yǎng)、自由飲水、飲食，室溫為20℃～23℃，相對(duì)濕度為50%～70%，光照12 h/天，更換墊料2～3次/周，保持通風(fēng)。ICR小鼠專用飼料和墊料均由上海生工生物技術(shù)有限公司提供。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（C組，n=6）和運(yùn)動(dòng)組（n=24），運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行一次性力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)力竭后再次分為運(yùn)動(dòng)后即刻組0 h（n=6）、6 h組（n=6）、12 h組（n=6）和24 h組（n=6）。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練3天，坡度為0℃，速度為15 m/min，持續(xù)30 min/day。正式運(yùn)動(dòng)參照Bedford根據(jù)鼠體重/攝氧量回歸方程所建立的遞增運(yùn)動(dòng)負(fù)荷訓(xùn)練方案[8]，按以下程序運(yùn)動(dòng)：第1級(jí)負(fù)荷：0°，8.2 m/min（相當(dāng)于53%VO2max），15 min；第2級(jí)負(fù)荷：5°，15 m/min（相當(dāng)于64%VO2max），15min；第 3級(jí)負(fù)荷：10°，19.3 m/min（相當(dāng)于 76%VO2max）運(yùn)動(dòng)至力竭。運(yùn)動(dòng)時(shí)使用毛刷刺激，使動(dòng)物保持在跑道前1/3處，以保證運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。待小鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)至不能堅(jiān)持原跑速，刺激驅(qū)趕無(wú)效，停跑后體征表現(xiàn)為俯臥位，呼吸急促，神情倦怠，對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍時(shí)，判定為力竭[9]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每只小鼠跑的力竭時(shí)間被記錄，平均力竭時(shí)間為173.83±13.75 min。

1.3 取材

安靜對(duì)照組在安靜狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)組于運(yùn)動(dòng)后對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)頸椎脫臼處死小鼠，迅速取左側(cè)腓腸肌稱重，用于生化測(cè)試，右側(cè)腓腸肌切分若干份裝入已標(biāo)記好的凍存管，迅速置于液氮中，然后轉(zhuǎn)到－80℃冰箱保存，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。

1.4 生化測(cè)定

腓腸肌T-SOD、CuznSOD和MnSOD活性均采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，T-AOC含量采用比色法測(cè)定，生化具體操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，均采用Tecan 2000型酶標(biāo)儀檢測(cè)，蛋白定量采用BCA法。

1.5 Real-Time PCRe PCR檢測(cè)

冰上取腓腸肌約40 mg采用Invitrogen Trizol法提取總RNA，總RNA的OD260/OD280的比值采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算選取符合Real-time PCR要求的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄時(shí)取5 μl RNA樣品，配置10 μl的總反應(yīng)體系，使用TOYOBO FSQ101反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA（15℃，5 min；37℃，15 min；85℃，5 min）；以合成的cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，在ABI StepOne型實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行熒光定量，反應(yīng)條件為：95℃15 s，61℃30 s，72℃45 s，40個(gè)PCR循環(huán)。PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算各樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔΔCt=（Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因－Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因）－（Ct對(duì)照組組目的基因－Ct對(duì)照組內(nèi)參基因）。熒光染料為TOYOBO QPK201 SYBR GREEN，實(shí)驗(yàn)所用引物均參照GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.6 Western Blot Blot檢測(cè)

取腓腸肌約50 mg冰上剪碎入研磨管中，按照Beyotime P0013 Western及IP裂解液說(shuō)明書加入0.5 ml裂解液（含1mM PMSF），OMINI Bead Ruptor 24 型磁珠勻漿機(jī)勻漿，14000 g離心15 min，上清轉(zhuǎn)入離心管，BCA法測(cè)定蛋白濃度后蛋白變性。采用10%、12%分離膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；使用5%脫脂奶粉封閉，一抗（Anti-Beclin1、Anti-Bcl2和Anti-P62稀釋比例分別為1∶1000、1∶200和1∶200，購(gòu)于美國(guó)CST或Santa Cruz公司）4℃孵育12 h，TBST緩沖液清洗后，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，Millipore ECL超敏試劑盒顯影，AlphaFC2型凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行冷光掃膜，使用FluorChem FC2軟件對(duì)所捕捉圖像進(jìn)行灰度值分析，內(nèi)參為GAPDH，實(shí)驗(yàn)所用抗體購(gòu)于Santa Cruz或CST公司。

表1 各基因引物序列

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

各組檢測(cè)數(shù)據(jù)錄入Excel 2013，每組數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)和圖生成，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為顯著性水平，P＜0.01為極顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腓腸肌自噬相關(guān)因子Beclin1、Bcl2和P62 mRNA表達(dá)的影響

與安靜對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)后0 h、6 h小鼠腓腸肌Beclin1 mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)極顯著升高（P＜0.01），12 h、24 h均未出現(xiàn)顯著升高（P＞0.05，圖1A）；Bcl2 mRNA在運(yùn)動(dòng)后0 h、6 h、12 h和24 h的表達(dá)量均未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖1B）；P62 mRNA的表達(dá)量在運(yùn)動(dòng)后24 h出現(xiàn)極顯著升高（P＜0.01），0 h、6 h和12 h均未出現(xiàn)顯著升高（P＞0.05，圖1C）。

圖1 各組小鼠腓腸肌Beclin1 mRNA、Bcl2 mRNA和P62 mRNA表達(dá)量

2.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腓腸肌自噬相關(guān)因子Beclin1、Bcl2和P62蛋白表達(dá)的影響

與安靜對(duì)照組相比，小鼠腓腸肌Beclin1蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后0 h、6 h、12 h和24 h均未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖2A）；Bcl2蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后0 h、6 h和12 h出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），24 h未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖2B）；P62蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后0 h、12 h和24 h均出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），6 h未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖2C）。

2.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腓腸肌T-SOD、CuznSOD、MnSOD活性和T-AOC含量的影響

與安靜對(duì)照組相比，小鼠腓腸肌T-SOD活性在運(yùn)動(dòng)后6 h出現(xiàn)極顯著下降（P＜0.01），0 h、12 h和24 h均未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖3A）；CuznSOD活性在運(yùn)動(dòng)后0 h顯著增加（P＜0.05），6 h顯著下降（P＜0.05），12 h和24 h均未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖3B）；MnSOD活性在運(yùn)動(dòng)后0 h出現(xiàn)極顯著升高（P＜0.01），6 h、12 h和24 h均未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖3C）；T-AOC含量在運(yùn)動(dòng)后6 h、12 h和24 h均出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），0 h未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖3D）。

圖2 各組小鼠骨骼肌Beclin1、Bcl2和P62蛋白表達(dá)變化

圖3 各組小鼠骨骼肌T-SOD、CuznSOD和MnSOD的活性及T-AOC含量的變化

2.4 自噬相關(guān)因子P62蛋白表達(dá)與小鼠腓腸肌T-AOC含量和CuZnSOD活性的相關(guān)性分析

小鼠腓腸肌P62蛋白表達(dá)與T-AOC含量之間呈負(fù)相關(guān)（r=－0.6239，P＜0.01，圖 4A）；P62蛋白表達(dá)與CuZnSOD活性之間雖然未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（r=－0.3379，P=0.0678＞0.05，圖4B），但具有相關(guān)性趨勢(shì)。

圖4 小鼠腓腸肌T-AOC含量、CuZnSOD活性與P62蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌自噬相關(guān)因子Beclin1和P62表達(dá)的影響

自噬在骨骼肌肌纖維分解代謝中的作用引起學(xué)者們的普遍關(guān)注，關(guān)于骨骼肌分解代謝模型（饑餓、缺氧和惡液質(zhì)）的研究發(fā)現(xiàn)，自噬激活同時(shí)伴隨著蛋白轉(zhuǎn)換增加[10]。適宜負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)可提高骨骼肌細(xì)胞自噬水平，分析其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，自噬除了降解運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生和積累的破損、衰老的細(xì)胞器，還和合成或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)有關(guān)，從而為肌纖維更新代謝提供一定的能量與合成所需的底物，同時(shí)抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡和死亡[11]。但關(guān)于骨骼肌運(yùn)動(dòng)適應(yīng)過(guò)程中自噬調(diào)控的分子機(jī)制還不是很清楚。Beclin1（又稱Atg6）在真核細(xì)胞中高度保守，屬于自噬相關(guān)蛋白家族，在自噬體（autophagosome）的形成過(guò)程中是必需的。它可介導(dǎo)其它自噬蛋白定位于吞噬泡（phagophore），調(diào)控哺乳動(dòng)物自噬體的形成與成熟。Beclin1表達(dá)水平上升提示自噬活性增加[12]。而P62位于自噬體，其作用是募集蛋白質(zhì)進(jìn)入自噬體進(jìn)行降解，P62水平下降提示自噬活性增加，而P62積累提示自噬缺陷[13]。Jeong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，耐力游泳運(yùn)動(dòng)明顯增加小鼠骨骼肌Beclin1蛋白表達(dá)，明顯降低P62蛋白表達(dá)。Hecongcong[15]研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)明顯降低小鼠骨骼肌P62蛋白表達(dá)。Vitor等[16]研究發(fā)現(xiàn)，耐力轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)顯著增加小鼠骨骼肌Beclin1蛋白表達(dá)，并顯著降低P62蛋白表達(dá)，提示運(yùn)動(dòng)可有效增加骨骼肌自噬水平以維持骨骼肌收縮活動(dòng)和新陳代謝所需。

本研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后0 h和6 h小鼠骨骼肌Beclin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，0 h、12 h和24 h P62蛋白表達(dá)顯著降低，提示運(yùn)動(dòng)引起的Beclin1 mRNA表達(dá)增加反應(yīng)早，但延續(xù)時(shí)間相對(duì)短，而P62蛋白表達(dá)下調(diào)反應(yīng)早且延續(xù)的時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)。因此Beclin1 mRNA和P62蛋白表達(dá)可以同時(shí)作為一次性力竭運(yùn)動(dòng)后早期自噬反應(yīng)的敏感性指標(biāo)；P62蛋白表達(dá)還可以作為一次性力竭運(yùn)動(dòng)后延遲性自噬反應(yīng)的敏感性指標(biāo)。這些結(jié)果提示不同的自噬指標(biāo)對(duì)一次性力竭運(yùn)動(dòng)后的不同時(shí)程敏感性是不同的，故選擇合適地能夠反映自噬的指標(biāo)非常重要。本實(shí)驗(yàn)中Beclin1 mRNA和P62蛋白表達(dá)的變化提示一次性力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可激活骨骼肌自噬，是骨骼肌自噬強(qiáng)有力的誘導(dǎo)劑，這與先前的研究結(jié)果報(bào)道一致。但文獻(xiàn)中也有相反的報(bào)道，Kim等[17]研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動(dòng)顯著降低小鼠骨骼肌Beclin1蛋白表達(dá)，提示一次性力竭運(yùn)動(dòng)也可能減弱骨骼肌自噬信號(hào)途徑。造成上述研究結(jié)果不一致的原因可能如下：第一，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中能量消耗的不同（不同實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間均不同）可能決定自噬的活性。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）是能量狀態(tài)的敏感感受器，也是細(xì)胞自噬的重要激活因子。如果運(yùn)動(dòng)使骨骼肌肌纖維內(nèi)AMP/ATP比值顯著增加，則可激活其下游信號(hào)分子AMPK，后者可通過(guò)磷酸化Raptor的Ser722/Ser792位點(diǎn)或磷酸化TSC2 Thr1227/Ser1345位點(diǎn)抑制mTOR，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。但如果運(yùn)動(dòng)時(shí)能量消耗是暫時(shí)的且儲(chǔ)存在細(xì)胞中的能源物質(zhì)沒有耗盡時(shí)，自噬有可能不被激活，甚至降低[18]。故不同能量消耗可引起不同的自噬反應(yīng)。第二，運(yùn)動(dòng)前肌糖原含量不同，自噬反應(yīng)可能也不同。已有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)前肌糖原含量與AMPK活性呈負(fù)相關(guān)[19]。第三，自噬變化可能與不同肌纖維類型、處死時(shí)間、樣本的收集、飲食和年齡等內(nèi)在和外在因素有關(guān)系[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)一次性力竭運(yùn)動(dòng)后24 h骨骼肌P62 mRNA表達(dá)增加，與Tam等[21]的研究結(jié)果一致，但蛋白表達(dá)明顯下降。分析其原因可能是在自噬的降解階段，P62基因在轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)階段消耗了一部分（降解增加），其目的是為了避免自噬相關(guān)因子耗盡[22]；也有可能P62的作用除了作為自噬適應(yīng)物之外，還有其他的生物學(xué)作用，包括在Ras/Raf/MAPK和NF-κB通路、氧化應(yīng)激和腫瘤生成等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用[23]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動(dòng)并沒有使骨骼肌Beclin1蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，與Jamart[24]的研究結(jié)果一致。后者研究發(fā)現(xiàn)，禁食并沒有引起B(yǎng)eclin1蛋白表達(dá)的變化。同樣，Tam[21]發(fā)現(xiàn)禁食后的耐力運(yùn)動(dòng)并沒有導(dǎo)致骨骼肌Beclin1蛋白表達(dá)發(fā)生變化。運(yùn)動(dòng)性骨骼肌自噬的變化可能與禁食時(shí)誘導(dǎo)的自噬一致。分析Beclin1 mRNA表達(dá)增加而蛋白表達(dá)不增加的原因可能如下：其一，蛋白表達(dá)水平的變化與轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯及翻譯后水平調(diào)控及蛋白質(zhì)降解等均有關(guān)系；其二，蛋白的表達(dá)不一定與它相對(duì)應(yīng)的mRNA水平呈現(xiàn)同步表達(dá)[25]。已有人對(duì)同一基因的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)是否一致做了相關(guān)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)為0.46～0.68[26]，但其具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3.2 運(yùn)動(dòng)激活自噬相關(guān)因子Bcl2和P62對(duì)骨骼肌抗氧化防御功能的影響

B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl2，B cell lymphoma/leukemia-2）是一種含有多個(gè)BH結(jié)構(gòu)域的抗凋亡蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，它在調(diào)控細(xì)胞自噬過(guò)程中具有重要作用，通過(guò)與Beclin1的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成復(fù)合物，抑制Beclin1誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Bcl2與Beclin1的分離對(duì)于自噬的誘導(dǎo)至關(guān)重要[27]。Hecongcong[15]使用免疫沉淀反應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)15分鐘Bcl2與Beclin1復(fù)合物明顯下降，運(yùn)動(dòng)30分鐘，其復(fù)合物基本檢測(cè)不到。

有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2還可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)[28]。Veis[29]的研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2基因敲除小鼠的抗氧化防御功能存在缺陷。Kane等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2過(guò)表達(dá)提高細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）含量。Merad[31]采用過(guò)表達(dá)技術(shù)上調(diào)細(xì)胞中Bcl2蛋白的表達(dá)，以模擬SOD過(guò)表達(dá)的效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl2與SOD具有正相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動(dòng)后0 h、6 h和12 h骨骼肌Bcl2蛋白表達(dá)明顯增加，提示運(yùn)動(dòng)引起的Bcl2蛋白表達(dá)增加反應(yīng)早且延續(xù)時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)，它也可作為一次性力竭運(yùn)動(dòng)后即刻且延遲到運(yùn)動(dòng)后12 h自噬反應(yīng)的敏感性指標(biāo)。同時(shí)0 h骨骼肌MnSOD、CuznSOD活性均顯著增加，6 h、12 h和24 h骨骼肌TAOC含量也顯著增加，Bcl2蛋白表達(dá)的增加趨勢(shì)基本與骨骼肌抗氧化防御功能增加的趨勢(shì)一致，上述研究結(jié)果提示：當(dāng)主要位于線粒體膜的Bcl2蛋白表達(dá)增加時(shí)，MnSOD和CuznSOD活性增加，骨骼肌總T-AOC含量也明顯增加，這樣可以降低細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平，阻止氧化應(yīng)激的細(xì)胞損傷[28]。Bcl-2還能夠與GSH結(jié)合，清除線粒體氧化呼吸鏈上漏出的超氧陰離子等ROS[32]。有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2能夠影響細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ（COXⅣ）的活性進(jìn)而影響電子呼吸鏈的功能及線粒體超氧陰離子的水平[28]，同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，P62蛋白表達(dá)與骨骼肌T-AOC含量呈相關(guān)性，提示激活自噬相關(guān)因子Bcl2和P62的蛋白表達(dá)與骨骼肌抗氧化防御功能有關(guān)，其過(guò)程可能與Bcl2和P62的蛋白表達(dá)的、時(shí)間點(diǎn)活化有關(guān)，因此，Bcl2和P62或共同調(diào)控和增強(qiáng)骨骼肌的抗氧化防御功能，然而具體生物學(xué)分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動(dòng)并沒有引起骨骼肌Bcl2 mRNA表達(dá)變化，但Bcl2蛋白表達(dá)增加，分析原因：其一，可能與mRNA的產(chǎn)生效率有關(guān)。通常情況下，mRNA的產(chǎn)生效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于蛋白質(zhì)，某一給定的mRNA每小時(shí)只能復(fù)制2次，但同樣時(shí)間可以拷貝數(shù)十個(gè)相應(yīng)的蛋白；其二，mRNA穩(wěn)定性差，mRNA半衰期通常是2.6～7 h，而蛋白是46 h[33]。也有不同的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)使小鼠骨骼肌Bcl2 mRNA表達(dá)下降，可能是由于不同的運(yùn)動(dòng)方式、不同的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與運(yùn)動(dòng)時(shí)間導(dǎo)致小鼠骨骼肌Bcl2轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)產(chǎn)生不同的反應(yīng)[34]。

綜上所述，Bcl2和P62在自噬過(guò)程中可能起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，在骨骼肌抗氧化防御功能中也有重要作用，提示自噬和抗氧化防御系統(tǒng)之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系。關(guān)于運(yùn)動(dòng)、Bcl2、P62和抗氧化防御功能的確切分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

一次性力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可明顯激活骨骼肌自噬相關(guān)因子Beclin1 mRNA和P62蛋白的表達(dá)，可適度提高自噬，但不同自噬指標(biāo)對(duì)運(yùn)動(dòng)的敏感時(shí)程性不同，且激活后活性延遲的時(shí)間不同；一次性力竭運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)骨骼肌抗氧化防御功能，骨骼肌抗氧化防御功能的增加與自噬相關(guān)因子P62蛋白的表達(dá)具有相關(guān)性。