張 玲，周 青，汪 淵

肺癌在我國發(fā)病率高，病死率高.因早期無明顯癥狀，就診時往往已是中晚期，治療難度大，因此亟需開發(fā)肺癌敏感的藥物來抑制腫瘤細胞的惡性增殖，控制疾病的發(fā)展進程.N-（4-羥基苯基）維生素甲酰胺（4-HPR）是全反式維甲酸（ATRA）的衍生物，在國外乳腺癌、前列腺癌等研究中已進入了臨床試驗階段［1-2］，是一種強有力的化療藥物.肺癌的病理類型多，已發(fā)現(xiàn)的肺癌細胞株亦較多.

本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)4-HPR顯著抑制肺癌A549的增殖［3］.本實驗旨在觀察4-HPR對肺癌H1299細胞增殖的影響，為其用于臨床肺癌治療提供一定的理論和實驗依據(jù).

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司），胰酶、BCA試劑盒（Beyotime公司），細胞用DMSO（Appli?chem公司），CCK-8（南京建成生物公司），結(jié)晶紫染料（上海生工生物工程公司），4-HPR（MCE公司），ATRA（DC Chemicals公司），兔源抗人p-p38抗體（CST公司），兔源抗人p38、鼠源抗人β-actin抗體（santa cruz公司），兔來源抗鼠、羊來源抗兔IgG抗體（millipore公司），ECL試劑盒（Thermo fisher公司）.

主要儀器：細胞培養(yǎng)箱（Thermo fisher公司），超凈臺（蘇州凈化設備有限公司），倒置顯微鏡（奧林巴斯有限公司），化學發(fā)光成像儀（上海勤翔儀器公司）.

1.2 細胞培養(yǎng)

將H1299細胞株培養(yǎng)于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細胞長至80%～90%密度時用胰酶消化傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞接種于孔板中，進行后續(xù)實驗.

1.3 細胞增殖實驗

按4000個/孔細胞種入96孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)，貼壁后加藥處理.設置細胞對照組、溶劑對照組、1μmol 4-HPR組、5μmol 4-HPR組、10μmol 4-HPR組和50μmol 4-HPR組，每組設6個復孔，培養(yǎng)48h.加入CCK-8試劑，2h后用酶標儀測吸光度.根據(jù)各處理組吸光度（OD）值，計算藥物對細胞增殖的抑制率：（細胞對照組OD值-各處理組OD）/細胞對照組OD值×100%，繪制抑制率對藥物濃度的柱狀圖，分析4-HPR對細胞增殖的影響.

1.4 倒置顯微鏡下觀察

實驗分細胞對照組、溶劑對照組（0.1%DMSO）、10μmol/L 4-HPR組，共三組.待細胞長至40%～50%密度時加藥處理，48h后倒置顯微鏡下觀察，并拍照記錄.

1.5 平板克隆實驗

實驗分組同1.4，待細胞處于對數(shù)生長期，加藥處理48h，胰酶消化，分別收集各組細胞，吹打為單個細胞懸液，計數(shù)各孔細胞，稀釋至相同密度，并把細胞懸浮在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，分別接種于六孔板各孔.培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10天左右.棄去上清液，用PBS浸洗，加4%多聚甲醛固定.棄去后加1%結(jié)晶紫染色，然后用流水洗去染色液，倒置，空氣干燥.拍照記錄.在低倍鏡下計數(shù)大于50個細胞集落作為克隆數(shù).最后計算克隆形成率：（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%.

1.6 Western blot

收集藥物處理的細胞，分組同實驗1.4，加入RIPA緩沖液（Tris-HCl，pH 7.4；150mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，1%Triton，0.1%SDS，磷酸酶抑制劑）提取蛋白，BCA法蛋白定量.取50μg/孔蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上.5%脫脂奶粉封閉2h，加鼠源抗人、兔源抗人抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌后再加入相應濃度的兔來源抗鼠、羊來源抗兔IgG抗體室溫孵育2h，洗滌后用ECL試劑盒檢測，機器顯影，采用Image Pro Plus軟件進行灰度掃描，分析各條帶的灰度值，以p-p38/p38進行比值計算作半定量分析.

1.7 統(tǒng)計學處理

實驗重復3次，取其均值.采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以-x±s表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析.P＜0.05有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 梯度藥物對H1299細胞增殖的影響

如圖1結(jié)果所示，藥物作用48h，與細胞對照組比較，隨著4-HPR濃度增大，細胞增殖抑制率逐漸增大（P＜0.05）.25μmol/L抑制率已接近80%.選取10μmol/L藥物濃度進行后續(xù)實驗研究.溶劑對照組與細胞對照組比較無明顯抑制作用.

圖1 梯度藥物對細胞增殖抑制率與細胞對照組比較：＊P＜0.05

2.2 不同處理組H1299細胞生長變化

藥物處理48h，顯微鏡下可見細胞對照組、溶劑對照組細胞密度大，光澤度好（如圖2A、2B）.4-HPR組細胞數(shù)明顯減少，失去正常生長，細胞生長面之上漂浮有圓形死細胞（如圖2C）.

圖2 不同處理對細胞生長的影響×100

2.3 不同處理組H1299細胞增殖能力變化

平板克隆實驗結(jié)果表明，藥物作用48h后，細胞和溶劑對照組形成細胞集落能力強，細胞克隆密集，單個克隆體積大，兩組間克隆形成率沒有明顯差異（如圖3A、3B）.4-HPR組細胞克隆稀疏，單個克隆體積小，克隆形成率明顯降低（P＜0.05）（如圖3C）.

圖3 藥物處理細胞增殖能力的變化分組同圖2，與細胞對照組比較：＊P＜0.05

2.4 不同處理組H1299細胞蛋白表達變化

Western Blot結(jié)果分析表明，4-HPR組可明顯增加p38的磷酸化（p-p38）水平，細胞對照組與溶劑對照組中p-p38表達無明顯差異（P＜0.05）（如圖4所示）.

圖4 藥物處理細胞p-p38表達水平變化與細胞對照組比較：＊P＜0.05

3 討論

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤之一.全國腫瘤防治辦資料顯示，我國肺癌發(fā)病率年增長率為26.9%，若不采取控制措施，到2025年，肺癌患者將達到100萬，我國將成為世界第一肺癌大國［4］.ATRA是維生素A的主要活性代謝物，作為維甲酸類藥物的代表，已被用于治療急性早幼粒細胞性白血病［5］.然而ATRA使用會產(chǎn)生維甲酸綜合癥，并且長期使用會發(fā)生維甲酸抵抗，限制其在腫瘤治療中的應用［6］.4-HPR是ATRA眾多衍生物中對腫瘤抑制作用較強的合成物.在本研究中發(fā)現(xiàn)，4-HPR可顯著抑制人肺癌H1299細胞的增殖，10μmol/L的藥物濃度細胞增殖抑制率已接近30%.國外將4-HPR用于兒童神經(jīng)母細胞瘤的臨床治療，監(jiān)測血藥濃度發(fā)現(xiàn)，患兒血液中藥物濃度可以達到12.9μmol/L［7］.結(jié)合本研究中 4-HPR抑制肺癌細胞增殖的有效濃度，顯示將4-HPR用于肺癌的臨床治療是有前景的.

細胞增殖是以細胞分裂方式增加細胞數(shù)量的過程，是細胞生命活動的重要特征之一.當正常細胞在多種因素的影響下，周期調(diào)節(jié)失控，獲得自主生長信號，導致細胞無限增殖，就會產(chǎn)生腫瘤［8］.增殖不受控制是腫瘤細胞的最基本特性之一.肺癌的發(fā)生發(fā)展也是肺癌細胞無限增殖的結(jié)果.因此，本研究主要從細胞增殖方面，研究了4-HPR對肺癌H1299細胞株的作用.4-HPR作用后，鏡下可見H1299細胞明顯減少，肺癌細胞的克隆形成能力亦明顯降低.

細胞增殖失控過程中，多種蛋白及相關(guān)因子起了重要作用.通過對腫瘤細胞增殖相關(guān)的蛋白檢測，可以了解腫瘤細胞的增殖情況，再結(jié)合臨床檢查，可對腫瘤的早期診斷和預后評估提供幫助.同時，隨著分子生物學和基因工程技術(shù)的發(fā)展，以相關(guān)蛋白作為攻擊靶點，已研制出了一些抑制腫瘤細胞增殖的藥物，但針對某種特異性基因或蛋白的藥物仍然缺乏，需要繼續(xù)探索.絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族是細胞內(nèi)的主要信息傳遞系統(tǒng)，p38是MAPK家族成員之一，磷酸化后激活.大量研究證實，p38的活化水平對多種腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移等均有調(diào)控作用［9-13］.亞硒酸鈉抑制肺癌細胞A549增殖并促進p38磷酸化［14］，索拉菲尼抑制人口腔癌細胞增殖與p38的活化相關(guān)［15］，五味子乙素抑制結(jié)腸癌SW480細胞增殖和侵襲的同時p-p38蛋白水平明顯增加［16］.

本研究發(fā)現(xiàn)，4-HPR抑制細胞增殖過程中伴隨p38磷酸化水平的增加，與相關(guān)研究吻合.然而國外有研究報道，藥物抑制腫瘤細胞增殖、凋亡等生物學行為伴隨著p38的失活［17］.早前即有研究認為，MAPK家族在人不同組織腫瘤中的作用機制不同，因此所起的作用不同，甚至細胞周期的分期不同，這些酶的作用也不同［18］.故進一步探討p38信號通路在4-HPR抑制肺癌細胞增殖中的作用，對指導肺癌的防治具有重要價值.