張紅，馮繼紅，丁婷婷，泮紅飛，羅軍敏

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率較高[1]。超過(guò)三分之一的結(jié)直腸癌患者最終會(huì)發(fā)展成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。miRNA是一類小的非編碼RNA，含有約22個(gè)核苷酸[3]。 miRNA能部分結(jié)合3′UTR的特定靶mRNA，導(dǎo)致mRNA降解或抑制翻譯[4]。miRNA在細(xì)胞增殖、發(fā)育和分化等生物學(xué)進(jìn)程中起重要作用[5]，且多種類型的miRNA可能參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞行為[6]。miR-581是一類新近發(fā)現(xiàn)的miRNA分子，最近研究顯示，miR-581在肝癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織[7]，但對(duì)于其在其他組織中的研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道。我們?cè)谇捌诨A(chǔ)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-581在發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織。2013年6月～2017年6月，我們探究miR-581對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620、HT29、LOVO和人正常結(jié)直腸細(xì)胞FHC，購(gòu)于上海中科院，L-15培養(yǎng)基、McCoy′s 5 A、RPMI1640培養(yǎng)基和0.25%胰酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(FBS)和雙抗購(gòu)于美國(guó)?？寺」?；PBS磷酸鹽緩沖液購(gòu)于BOSTER。miR-581 mimics和pcDNA3.1-過(guò)氧化物氧化還原酶蛋白1(PRDX1)購(gòu)于上海吉瑪有限公司。氯仿、乙醇、異丙醇購(gòu)于重慶川東化工公司。TRIzol裂解液、Premix ExTaq Version2.0和SYBR Premix Ex Taq購(gòu)于日本Takara 公司。PCR 引物由上海Sangon Biotech公司合成。CCK-8試劑盒購(gòu)于日本DOJINDO公司。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)康寧公司。GAPDH小鼠抗人一抗、β-actin小鼠抗人一抗購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Western blotting凝膠試劑盒和全蛋白提取試劑盒購(gòu)于碧云天公司；ECL發(fā)光液購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司。SW620、LOVO、FHC細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的L-15培養(yǎng)基中，HT29細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的McCoy′s 5A培養(yǎng)基中，均于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底進(jìn)行傳代，以下實(shí)驗(yàn)均取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞分組及處理 PBS緩沖液將細(xì)胞清洗干凈，胰酶消化細(xì)胞2 min，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌15 mL離心管，離心并計(jì)數(shù)細(xì)胞，以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合率達(dá)70%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(加入miR-581 mimics)和對(duì)照組(加入vector)；無(wú)血清培養(yǎng)基將Lipofectamine2000按3 μL/L進(jìn)行稀釋，37 ℃孵育20 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基分別將miR-581 mimics和pcDNA3.1- PRDX1按50 μmol/L稀釋，常溫下孵育5 min，最后與Lipofectamine2000等體積分別混勻，分別加入兩組細(xì)胞中，37 ℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)；12 h后，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞狀態(tài)，并將無(wú)血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，提取細(xì)胞RNA，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.3 不同結(jié)直腸細(xì)胞株中miR-581表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。按照說(shuō)明書(shū)提取人正常結(jié)直腸細(xì)胞FHC和人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620、HT29、LOVO中的總microRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為內(nèi)參，利用熒光PCR儀檢測(cè)相應(yīng)cDNA中miR-581的相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)，獲取熒光信號(hào)溫度為60 ℃。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，重復(fù)3次。普通cDNA qRT-PCR檢測(cè)以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。選擇miR-581表達(dá)最低的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)miR-581 mimics組和對(duì)照組細(xì)胞增殖能力。消化并計(jì)數(shù)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞，以5 000個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵箱培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁，觀察細(xì)胞狀態(tài)，吸出培養(yǎng)基，避光條件下，將CCK-8試劑和完全培養(yǎng)基按1∶10比例混勻，分別加入每孔細(xì)胞中，37 ℃孵育1 h；將miR-581 mimics和mimics vector 分別轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞,酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處每孔細(xì)胞的吸光度值，并統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell侵襲試驗(yàn)。將5×104個(gè)SW620細(xì)胞置于上室，并加入Matrigel基質(zhì)膠(BD Bioscience，Woburn，MA，USA)。將具有10%FBS和HGF(20 ng/mL)的培養(yǎng)基置于下室中。37 ℃孵育24 h，小心去除上膜表面上的細(xì)胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來(lái)水沖洗干凈，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.6 熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定 構(gòu)建含 PRDX1 基因野生型 3′UTR(含 miR-581 識(shí)別位點(diǎn)/wt)、突變型 3′UTR(miR-581 識(shí)別位點(diǎn)點(diǎn)突變/mut)片段，兩端均設(shè)計(jì) XbaⅠ酶切位點(diǎn)，插入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL3-promoter，Promega)構(gòu)建 pGL3-3′UTR wt、pGL3-3′UTR mut。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞，將PRDX1與miR-581共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h據(jù)Promega公司操作說(shuō)明，裂解細(xì)胞，加入熒光素酶底物，檢測(cè)熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-581能否與PRDX1 3′UTR結(jié)合，證明miR-581是否能直接調(diào)控PRDX1。

1.7 SW620細(xì)胞中PRDX1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。根據(jù)PRDX1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小，配制凝膠，根據(jù)所測(cè)蛋白濃度適量加入蛋白樣品及每孔5 μL的蛋白Marker；跑膠，首先加壓80 V，保證所有樣品在同一水平線，待樣品至分離膠處，將電壓加至120 V；切膠，根據(jù)所需條帶大小，對(duì)照蛋白Marker進(jìn)行切膠，并準(zhǔn)備與所切膠條相同大小濾紙2片和PVDF膜(浸泡甲醇15 s)；按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序按序排好，并趕出氣泡，壓緊，在250 mA恒流下，按1 kD蛋白1 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PBST洗膜1次，并放入脫脂奶粉中封閉1 h;一抗，PBST洗膜1次，將膜浸入稀釋好的一抗中，4 ℃過(guò)夜；二抗，PBST洗膜3次，將膜浸入稀釋好的二抗中，常溫下孵育1 h；顯影，PBST洗膜3次后，在暗室中曝光，并分析。

1.8 SW620細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-581 mimics和PRDX1質(zhì)粒后的增殖能力檢測(cè) 將SW620細(xì)胞分為miR-581 mimics組、miR-581+PRDX1組，前者轉(zhuǎn)染miR-581 mimics，后者將miR-581 mimics與pcDNA3.1- PRDX1共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法同方法1.2，待轉(zhuǎn)染48 h后，消化細(xì)胞，同方法1.4通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。

1.9 SW620細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-581 mimics和PRDX1質(zhì)粒后的侵襲能力檢測(cè) 將SW620細(xì)胞分為miR-581 mimics組、miR-581+PROX1組，前者轉(zhuǎn)染miR-581 mimics，后者miR-581 mimics與pcDNA3.1- PRDX1共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法同方法1.2，待轉(zhuǎn)染48 h后，消化細(xì)胞，同方法1.5通過(guò)Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。

2 結(jié)果

2.1 miR-581在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)比較 miR-581在人正常結(jié)直腸細(xì)胞FHC和人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620、HT29、LOVO的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.13、0.50±0.12、0.47±0.21、0.65±0.09，miR-581在SW620細(xì)胞中的表達(dá)低于其他結(jié)直腸癌細(xì)胞株(P均<0.05)。

2.2 miR-581對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖能力的影響 miR-581 mimics組、對(duì)照組中miR-581相對(duì)表達(dá)量分別為8.81±0.42、1.25±0.37,P<0.05。miR-581 mimics組細(xì)胞增殖能力弱于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 miR-581對(duì)SW620細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 miR-581 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620侵襲能力的影響 對(duì)照組通過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量為(174.5±12.8)個(gè)/HP，miR-581 mimics組為(87.1±11.4)個(gè)/HP，兩組比較，P<0.05。

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果 野生型質(zhì)粒與miR-581 mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，顯著降低相對(duì)熒光素酶活性(1.04±0.12 vs 1.53±0.03，P<0.05)，而突變型質(zhì)粒與miR-581 mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，熒光素酶活性無(wú)明顯改變(1.64±0.04 vs 1.59±0.06，P>0.05)。miR-581能與PRDX1 3′UTR特異性結(jié)合。

2.5 miR-581對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620中PRDX1蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組、PRDX1組、miR-581 mimics組、miR-581+PRDX1組PRDX1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.15±0.34、2.87±0.28、0.40±0.09、1.95±0.37，四組間兩兩比較，P均<0.05。

2.6 PRDX1逆轉(zhuǎn)miR-581 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620增殖能力的影響 第5天，miR-581+PRDX1組細(xì)胞增殖能力較miR-581 mimics組強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

圖2 PRDX1干預(yù)后miR-581 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞

2.7 PRDX1逆轉(zhuǎn)miR-581 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620侵襲能力的影響 SW620細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-581 mimics和PRDX1質(zhì)粒后的侵襲能力，較單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-581 mimics更強(qiáng)，但弱于單獨(dú)轉(zhuǎn)染PRDX1質(zhì)粒的SW620細(xì)胞，細(xì)胞穿膜數(shù)分別為259.2±23.3、94.2±17.1、202.1±27.5，P<0.05。

3 討論

多種在腫瘤中異常表達(dá)的miRNAs分子，在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[8]，miRNAs可靶向調(diào)控多種基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程，與各種臨床腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)合前期試驗(yàn)基礎(chǔ)微陣列實(shí)驗(yàn)及實(shí)時(shí)熒光定量檢查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-581在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，且在轉(zhuǎn)移性癌組織中表達(dá)明顯降低，因此，我們推測(cè)miR-581在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-581是否在結(jié)直腸癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，我們首先通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-581 mimics上調(diào)SW620細(xì)胞中miR-581的表達(dá)，CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞增殖能力減弱，同時(shí)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示miR-581能降低其侵襲能力。說(shuō)明miR-581可能是潛在的抑癌基因，但miR-581在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

氧化應(yīng)激在多種癌癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。主要是由于活性氧(ROS)的過(guò)度產(chǎn)生導(dǎo)致DNA的結(jié)構(gòu)損傷，如插入、缺失、堿基對(duì)突變或重排[10]。另外，ROS可直接激活細(xì)胞核與惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[11]。過(guò)氧化物毒素(PRDX)是具有復(fù)雜寡聚體的蛋白質(zhì)家族結(jié)構(gòu)的一類巰基過(guò)氧化物酶，哺乳動(dòng)物有六種不同的PRDX ，各種類型的PRDX具有多種甚至相反的功能[12]。已證明PRDX1在乳腺癌[13]、惡性間皮瘤[14]和肺癌[15]組織中過(guò)度表達(dá)。此外，PRDX1與致癌基因的產(chǎn)物c-Abl和c-Myc相互作用，從而抑制c-Abl激酶活性[16]和c-Myc介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作用[17]。

而我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，PRDX1可促進(jìn)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞EMT的發(fā)生，從而增強(qiáng)結(jié)腸癌 SW480 細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[18]。我們通過(guò)Targetscan網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)PRDX1與miR-581具有相似的結(jié)合位點(diǎn)，兩者可能有內(nèi)在調(diào)控關(guān)聯(lián)。故我們選擇雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-581和PRDX1的相關(guān)作用關(guān)系。結(jié)果與我們的猜測(cè)一致，野生型質(zhì)粒與miR-581 mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，熒光素酶活性顯著降低，而突變型質(zhì)粒與miR-581 mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，熒光素酶活性無(wú)明顯改變。此外，我們還發(fā)現(xiàn)PRDX1的過(guò)表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了miR-581對(duì)SW620細(xì)胞中增殖和侵襲的抑制作用。因此，PRDX1是miR-581的直接靶標(biāo)，并且參與miR-581對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞調(diào)控的影響。

綜上所述，miR-581可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控PRDX1有關(guān)。