馮揚(yáng) 賴(lài)重媛 陳靜燕 古力切木·艾麥爾 廖松潔

神經(jīng)病理性疼痛(NP)是由體感神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病理?yè)p傷所直接導(dǎo)致的疼痛，在全球范圍內(nèi)的患病率是6.9%～10.0%[1-2]。NP對(duì)患者的身心健康產(chǎn)生不容忽視的不良影響[3]。由于NP的發(fā)生機(jī)制未知領(lǐng)域眾多，導(dǎo)致目前臨床療效尚不理想。因此，對(duì)參與NP發(fā)生機(jī)制的更深入研究極具臨床和科研價(jià)值。自噬是細(xì)胞內(nèi)降解長(zhǎng)壽蛋白與細(xì)胞器的一條主要通路，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，在神經(jīng)病學(xué)領(lǐng)域，自噬與帕金森病、老年癡呆、肌肉病及腦血管疾病密切相關(guān)，而在以NP為表現(xiàn)的有關(guān)周?chē)窠?jīng)病的研究中，自噬也成為了新的研究方向[4-8]。最近研究顯示在不同的NP模型中，脊髓的自噬改變雖然不完全相同，但抑制自噬后大鼠疼痛加重，提示增強(qiáng)自噬可以成為治療NP的新方向[9]。不少文獻(xiàn)報(bào)道NP中脊髓背角不同神經(jīng)細(xì)胞自噬水平的改變可能參與其發(fā)生與發(fā)展[10-12]。而在經(jīng)典的周?chē)窠?jīng)病理性疼痛模型即坐骨神經(jīng)壓迫模型(CCI)中，以坐骨神經(jīng)探討自噬的相關(guān)改變較少，筆者見(jiàn)目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)尚無(wú)報(bào)道。因此，為了提高對(duì)NP中坐骨神經(jīng)自噬發(fā)生的認(rèn)識(shí)，筆者觀察了大鼠慢性神經(jīng)壓迫后坐骨神經(jīng)自噬水平的表達(dá)，并進(jìn)一步觀察坐骨神經(jīng)內(nèi)不同神經(jīng)細(xì)胞的自噬形態(tài)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用36只體質(zhì)量250～280 g、8周齡的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK粵2013-0011)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。大鼠置于SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，12 h光照，自由飲水進(jìn)食，本研究中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理規(guī)范進(jìn)行飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。

二、材 料

小動(dòng)物手術(shù)器械購(gòu)于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；觸覺(jué)測(cè)量套件購(gòu)于Ugo Basile中國(guó)分公司；生理鹽水、電鏡固定液購(gòu)于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院；dylight 488標(biāo)記的山羊抗兔二抗免疫球蛋白G(1∶800，Jackson Immuno Reseach公司)；兔抗大鼠LC3抗體(1∶1 000，CST公司)；兔抗大鼠P62抗體(1∶500，CST公司)；HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗(1∶2 000，CST公司)。

三、方 法

1.動(dòng)物分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將36只大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)和坐骨神經(jīng)結(jié)扎組(CCI組)各18只。術(shù)前1 d測(cè)定2組大鼠的足底基礎(chǔ)痛閾值，術(shù)后1、4、7 d再次評(píng)定。術(shù)后4 d或7 d處死大鼠，2組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各9只大鼠，其中3只取坐骨神經(jīng)組織行蛋白免疫印跡檢測(cè)自噬特異蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、P62蛋白的表達(dá)，3只冰凍切片后行免疫熒光檢測(cè)LC3，余下3只行透射電鏡觀察坐骨神經(jīng)的自噬狀態(tài)。

2.模型制備

根據(jù)Bennet等[13]的研究制作CCI模型，在無(wú)菌條件下進(jìn)行操作，以10%水合氯醛(300～400 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，將大鼠置于俯臥位固定，從右側(cè)大腿中部作1 cm長(zhǎng)切口，沿股二頭肌方向鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)主干。用3根3-0絲線(先用生理鹽水浸泡)間隔約1 mm結(jié)扎，使神經(jīng)的直徑縮窄1/3，結(jié)扎力道以引起小腿肌肉輕微顫動(dòng)反應(yīng)為宜，逐層縫合手術(shù)切口。Sham組大鼠則切開(kāi)右后肢皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)后立即縫合，僅暴露不結(jié)扎。

3.疼痛行為學(xué)測(cè)試

以大鼠機(jī)械性縮足反射閾值(MWT)評(píng)價(jià)疼痛，通過(guò)Chaplan等[14]的Up-down法于術(shù)前1 d測(cè)定MWT，術(shù)后第1、4、7日再次評(píng)定。該方法如下：將大鼠置于帶有金屬網(wǎng)底板的有機(jī)玻璃盒中，待大鼠較安靜時(shí)，采用8根強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞增方式的Von Frey纖維絲，緩慢垂直刺向其右側(cè)后足掌部，避開(kāi)爪墊，使Von Frey絲發(fā)生彎曲并持續(xù)6～8 s。若大鼠在測(cè)試時(shí)或移開(kāi)纖維絲時(shí)立刻出現(xiàn)快速的撤足反應(yīng)，則記為陽(yáng)性，若無(wú)反應(yīng)，則為陰性。以2.0 g為初始刺激強(qiáng)度，若出現(xiàn)陰性反應(yīng)給予相鄰大一級(jí)的力度刺激；若出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則給予相鄰小一級(jí)的力度刺激，如此反復(fù)，以第一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)的前一個(gè)點(diǎn)為起點(diǎn)，再向下連續(xù)測(cè)定5次，刺激結(jié)果為最終的撤足反應(yīng)模式。根據(jù)Chaplan等[14]的計(jì)算方法，通過(guò)特定的程序?qū)⒊纷惴磻?yīng)模式轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的撤足閾值(單位：m/g)。

4.坐骨神經(jīng)組織準(zhǔn)備

術(shù)后第4日和第7日，取Sham組及CCI組各9只大鼠，予腹腔麻醉后，將其中3只大鼠左心室灌注4 ℃生理鹽水，快速取出術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)，置于預(yù)冷的1.5 ml 離心管中，立即投入液氮中急凍，隨后取出放于超低溫冰箱備用。再將3只大鼠的左心室行4%多聚甲醛灌注固定，快速取出術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)(結(jié)扎處遠(yuǎn)近段約5 mm)，固定6 h，再浸泡于20%、30%蔗糖溶液于4 ℃梯度脫水，待組織沉底后，使用聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物(OCT)包埋，行坐骨神經(jīng)橫切面冰凍切片，片厚14 μm。余下3只大鼠予腹腔麻醉后，快速取大小約為1 mm×1 mm×1 mm的術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)組織，投入電鏡固定液中，于4 ℃固定2～4 h。

5.免疫熒光檢查

取冰凍切片進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，一抗為兔抗大鼠LC3抗體(1∶200，CST公司)，于4 ℃過(guò)夜，加入熒光二抗dylight 488標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(1∶800，Jackson Immuno Reseach公司)室溫孵育1 h，滴加含4，6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并記錄LC3的表達(dá)。

6.蛋白免疫印跡

從超低溫冰箱取出坐骨神經(jīng)樣本，提取蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)所測(cè)蛋白濃度配制蛋白樣品，將蛋白樣品煮沸5 min。將30 μg蛋白上樣至12%濃度的變性聚丙稀酰胺凝膠，電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，置5%脫脂奶粉(CST)室溫封閉1 h，分別加入兔抗大鼠LC3抗體(1∶1 000，CST公司)、P62抗體(1∶500，CST公司)，于4 ℃搖床過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗(1∶2 000，CST公司)，于搖床孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液(Millipore公司)曝光顯影。用ImageJ軟件分析各條帶的吸光度(A值)，計(jì)算目的蛋白與β-actin A值的比值即為相對(duì)表達(dá)水平。

7.電鏡檢查

從4 ℃冰箱取出固定的坐骨神經(jīng)，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)充分漂洗，經(jīng)1%鋨酸室溫下固定2 h，充分漂洗，置于乙醇中梯度脫水，于丙酮812包埋劑混合液(1∶1)中滲透過(guò)夜。包埋劑包埋樣本后，行超薄切片，經(jīng)鈾鉛雙層染色，室溫風(fēng)干。置于電鏡下尋找自噬體：定義為細(xì)胞中包裹著線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器或其他胞漿物質(zhì)的雙層膜結(jié)構(gòu)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、疼痛行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

2組大鼠基線評(píng)分(足底基礎(chǔ)痛閾值)相等；Sham組術(shù)后第1、4、7日痛閾值均正常。經(jīng)重復(fù)測(cè)量的方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間與組別之間的交互效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，也即Sham組和CCI組大鼠術(shù)后痛閾值降低隨時(shí)間的變化趨勢(shì)不同。術(shù)后第1、4、7日2組痛閾值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)表1。

二、坐骨神經(jīng)自噬的變化

1.免疫熒光結(jié)果

Sham組為均質(zhì)綠染的LC3熒光信號(hào)，與Sham組比較，CCI組術(shù)后第4日及第7日出現(xiàn)較多綠色熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

表1 Sham組與CCI組各時(shí)間點(diǎn)MWT的變化 m/g

圖1 Sham組、CCI術(shù)后第4日、術(shù)后第7日大鼠坐骨神經(jīng)LC3與DAPI雙標(biāo)圖

2.蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

Sham組坐骨神經(jīng)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平低，P62蛋白表達(dá)明顯；與Sham組比較，CCI術(shù)后第4日，LC3-Ⅱ蛋白水平增高，P62蛋白表達(dá)減少(P均<0.01)，至CCI術(shù)后第7日，LC3-Ⅱ蛋白水平進(jìn)一步上升(P<0.001)， P62蛋白表達(dá)水平亦較CCI術(shù)后第4日有所上升(P<0.05)，見(jiàn)表2及圖2。

表2 Sham組與CCI術(shù)后第4日、術(shù)后第7日大鼠坐骨神經(jīng)LC3-Ⅱ及P62的相對(duì)蛋白灰度值

注：a與Sham組比較的P值；b與CCI 4 d比較的P值

圖2 蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

3.電鏡觀察結(jié)果

CCI術(shù)后第4日，大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘腫脹，板層松散，髓鞘碎片形狀大小不一，施萬(wàn)細(xì)胞呈幼稚化改變，核質(zhì)比增大，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)膜結(jié)合碎片與溶酶體形成自噬溶酶體，也可見(jiàn)有雙層膜的自噬體，有髓纖維及部分無(wú)髓纖維內(nèi)可見(jiàn)雙層膜的自噬體及自噬溶酶體，見(jiàn)圖3A～C。CCI術(shù)后第7日，大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘扭曲、溶解消失呈空泡狀，髓鞘碎片少，可見(jiàn)幼稚的施萬(wàn)細(xì)胞及成髓鞘的施萬(wàn)細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)含有不同自噬階段的自噬體，僅少數(shù)有髓纖維出現(xiàn)微絲微管溶解，可見(jiàn)自噬溶酶體，見(jiàn)圖3D、E。

圖3 電鏡觀察CCI術(shù)后第4日、術(shù)后第7日大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)(×20 000)

討 論

自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種“自食”現(xiàn)象，是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)源的膜包繞胞質(zhì)內(nèi)蛋白與細(xì)胞器形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，之后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，降解自噬體內(nèi)容物，生成的產(chǎn)物供細(xì)胞循環(huán)再利用，這個(gè)過(guò)程也稱(chēng)為自噬流[15]。在本研究中，筆者通過(guò)透射電鏡觀察CCI組大鼠的坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)，在施萬(wàn)細(xì)胞的胞質(zhì)、有髓纖維及部分無(wú)髓纖維的神經(jīng)元軸突內(nèi)均可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體及自噬溶酶體，提示CCI后損傷神經(jīng)的施萬(wàn)細(xì)胞及軸突神經(jīng)元內(nèi)發(fā)生了自噬。另有研究表明在大鼠Wallerian變性模型中，坐骨神經(jīng)通過(guò)神經(jīng)元軸突自噬及施萬(wàn)細(xì)胞吞噬的方式清除變性軸突[16]。由此可知CCI后坐骨神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞及軸突神經(jīng)元通過(guò)自噬清除變性組織，從而創(chuàng)造影響NP的微環(huán)境。

自噬高度相關(guān)蛋白LC3在自噬體膜的延伸和成熟中發(fā)揮關(guān)鍵作用，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)被ATG4蛋白酶解掉一小段多肽，在ATG7、ATG3及ATG12形成復(fù)合物作用下，與磷脂酰乙醇胺共軛，形成膜結(jié)合型LC3(即LC3-Ⅱ)[17]。在2016年自噬研究指南中，以LC3-Ⅱ/actin作為自噬研究的關(guān)鍵指標(biāo)。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，因此只檢測(cè)自噬體并不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)自噬情況，還要檢測(cè)自噬的降解途徑是否順暢。P62是自噬溶酶體基本物質(zhì)及泛素化結(jié)合蛋白，經(jīng)自噬途徑降解，與自噬泡清除水平密切相關(guān)，常作為反映自噬流的一個(gè)指標(biāo)[18]。曾有研究報(bào)道在C57b1/6實(shí)驗(yàn)小鼠的CCI模型中發(fā)現(xiàn)周?chē)窠?jīng)損傷1周內(nèi)自噬被激活，但自噬過(guò)程未能正常完成[19]。筆者通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果同樣印證了CCI后自噬的激活，但是與之前研究不同的是，我們采用的是不同的動(dòng)物品種及自噬檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在CCI術(shù)后第4日，坐骨神經(jīng)的自噬活性及自噬降解速度更強(qiáng)更快，至第7日，自噬體的下游降解能力減弱，提示大鼠坐骨神經(jīng)損傷后局部自噬激活發(fā)生了動(dòng)態(tài)的變化。

大鼠CCI模型是經(jīng)典的誘導(dǎo)NP 的動(dòng)物模型，通過(guò)輕度結(jié)扎坐骨神經(jīng)，使有髓神經(jīng)纖維選擇性地?fù)p傷，并保留多數(shù)傳遞痛感的C類(lèi)纖維[13,20]。該模型能模擬神經(jīng)受壓的臨床病例，影響神經(jīng)血供和軸索運(yùn)輸。在本研究中，筆者根據(jù)大鼠造模后的行為學(xué)改變進(jìn)行測(cè)定，從而證明了CCI大鼠NP模型的成功建立。另外，還對(duì)大鼠CCI后坐骨神經(jīng)局部自噬水平的表達(dá)及不同神經(jīng)細(xì)胞的自噬形態(tài)進(jìn)行了觀察。但是自噬在不同神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞相互間是如何進(jìn)行調(diào)控的，仍待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，大鼠坐骨神經(jīng)損傷后局部自噬激活發(fā)生了動(dòng)態(tài)的變化，不同的神經(jīng)細(xì)胞之間(施萬(wàn)細(xì)胞及軸突神經(jīng)元)通過(guò)自噬清除變性組織，共同參與影響NP的微環(huán)境。在本研究中，筆者對(duì)NP中坐骨神經(jīng)局部自噬的發(fā)生進(jìn)行了初步探究，下一步將進(jìn)行調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究，以期為今后的治療開(kāi)拓新方向。