劉亮，劉江惠，陳樂(lè)彤，巨英超，王靜，周榮秒，黃茜，霍向然，田蕓婕

肝癌是較常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率高，預(yù)后較差，盡管肝癌的治療方法包括手術(shù)、介入治療及放化療等綜合治療，但5年生存率仍然很低[1-2]。尋找高效低毒的抗肝癌藥物具有重要意義，尤其對(duì)于晚期肝癌不能手術(shù)的患者意義重大。青蒿琥酯(artesunate，ART)是我國(guó)經(jīng)典的抗瘧藥物[3-4]，尤其對(duì)于重型及耐藥型瘧疾患者具有較好的療效[5-7]。研究顯示，青蒿琥酯還具有抗腫瘤的特性[8-10]。本課題小組前期研究提示青蒿琥酯對(duì)食管癌及胃癌細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用[11-14]，但其對(duì)肝癌的生長(zhǎng)抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究探討青蒿琥酯對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 注射用青蒿琥酯(60mg，批號(hào)：LA150444)購(gòu)自桂林南藥股份有限公司。Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)凋亡試劑盒(LOT：I1711-W481Z)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。碘化丙啶(LOT：5338528)購(gòu)自美國(guó)BD公司。FC500型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 MTT法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/ml，將SMMC-7721細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁后棄培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的青蒿琥酯(0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、400、800μg/ml)，陰性對(duì)照組加入等體積生理鹽水，反應(yīng)總體積200μl/孔，另設(shè)空白對(duì)照孔，只加培養(yǎng)液，每個(gè)藥物劑量均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用24h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl、培養(yǎng)液180μl，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入180μl DMSO，振蕩10min。選擇490nm波長(zhǎng)，以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光密度(A)值A(chǔ)490，按下列公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率(IR，%)=(1－用藥組A490/對(duì)照組A490)×100%。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。接種細(xì)胞于含10%胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)基(補(bǔ)充青霉素、鏈霉素各100U/L)中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞按5×106密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，將其分為對(duì)照組及30、60、120μg/ml ART組，對(duì)照組使用生理鹽水，ART組則加入不同濃度的青蒿琥酯，使其終濃度分別達(dá)到30、60、120μg/ml，作用24h后，收集細(xì)胞，PBS液洗滌2次，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾制備成合格的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 倒置顯微鏡觀察青蒿琥酯作用后的SMMC-7721細(xì)胞形態(tài) 30、60、120μg/ml ART及生理鹽水作用SMMC-7721細(xì)胞24h后，利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取上述制備的單細(xì)胞懸液1ml(含1×106細(xì)胞)，冷PBS洗滌1次；加入100μl冷1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，10μl Annexin V-FITC，4℃避光放置15min；再加入380μl 1×結(jié)合緩沖液，10μl PI染液，4℃避光放置15min；冷PBS洗滌細(xì)胞1次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位 取上述制備的單細(xì)胞懸液1ml(含1×106細(xì)胞)，冷PBS洗滌細(xì)胞1次；100μl PBS液懸浮細(xì)胞，加入羅丹明123(Rhodamine123，Rho 123)染料，使最終濃度達(dá)到10μg/ml，于37℃下避光平衡30min；PBS洗滌細(xì)胞1次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以平均熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞線粒體膜電位水平。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 取上述制備的單細(xì)胞懸液1ml(含1×106細(xì)胞)，冷PBS洗滌1次；加入碘化丙啶染液1ml，4℃避光染色30min；以500目銅網(wǎng)過(guò)濾，使樣品成為合格的單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞增殖狀態(tài)以增殖指數(shù)表示，增殖指數(shù)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá) 取上述制備的單細(xì)胞懸液1ml(含1×106細(xì)胞)，冷PBS洗滌1次；100μl PBS液懸浮細(xì)胞，分別向其中加入Bcl-2及Bax抗體100μl，室溫放置30min；PBS洗滌，100μl PBS液懸浮細(xì)胞，分別向其中加入FITC標(biāo)記的二抗100μl，室溫避光放置30min；PBS洗滌，1ml PBS液懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)，以平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以表示，多組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)青蒿琥酯抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng) 不同濃度青蒿琥酯作用SMMC-7721細(xì)胞24h后，SMMC-7721細(xì)胞呈現(xiàn)出不同程度的生長(zhǎng)抑制，且隨著青蒿琥酯濃度的增加，SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用越來(lái)越明顯，具有劑量依賴性(圖1)。青蒿琥酯作用SMMC-7721細(xì)胞24h的IC50=(60.27±1.51)μg/ml。

圖1 青蒿琥酯作用24h后肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率 (MTT，n=3)Fig.1 Inhibition rate of SMMC-7721 cells after treatment with artesunate (MTT, n=3)

2.2 倒置顯微鏡觀察青蒿琥酯干預(yù)后的SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)變化 青蒿琥酯作用SMMC-7721細(xì)胞24h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示，對(duì)照組SMMC-7721細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞呈菱形或梭形，排列緊密，未見(jiàn)明顯的死亡細(xì)胞及漂浮的細(xì)胞。ART組呈現(xiàn)出不同程度的死亡SMMC-7721細(xì)胞及漂浮細(xì)胞，可見(jiàn)貼壁細(xì)胞中出現(xiàn)不同程度死亡細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)更不規(guī)則，出現(xiàn)大量碎裂及變圓的細(xì)胞，隨著青蒿琥酯濃度的增加可見(jiàn)死亡細(xì)胞及漂浮細(xì)胞增多(圖2)。

2.3 青蒿琥酯作用下SMMC-7721細(xì)胞凋亡水平 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，30、60、120μg/ml ART作用SMMC-7721細(xì)胞24h，細(xì)胞凋亡率(分別為4.44%±0.32%、6.54%±0.84%、12.92%±1.22%)與對(duì)照組(2.15%±0.10%)比較明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；120μg/ml ART組細(xì)胞凋亡率明顯高于30μg/ml及60μg/ml ART組(P＜0.01，圖3)。

圖2 青蒿琥酯作用下肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)(倒置顯微鏡 ×200)Fig.2 Morphology of SMMC-7721 cells after treatment with artesunate (Inverted microscope ×200)

圖3 青蒿琥酯作用下肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡率(流式細(xì)胞術(shù)，n=3)Fig.3 Apoptotic rate of SMMC-7721 cells after treatment with artesunate (Flow cytometry, n=3)

2.4 青蒿琥酯作用下SMMC-7721細(xì)胞線粒體膜電位水平 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，30、60、120μg/ml ART作用SMMC-7721細(xì)胞24h，細(xì)胞線粒體膜電位水平(分別為244.36±3.27、229.51±4.74、173.17±6.93)與對(duì)照組(277.82±5.68)比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；且120μg/ml組細(xì)胞線粒體膜電位水平明顯低于30μg/ml及60μg/ml ART組(P＜0.01，圖4)。

圖4 青蒿琥酯作用下肝癌SMMC-7721細(xì)胞線粒體膜電位水平(流式細(xì)胞術(shù)，n=3)Fig.4 Mitochondrial membrane potential of SMMC-7721 cells after treatment with artesunate (Flow cytometry, n=3)

2.5 青蒿琥酯作用下SMMC-7721細(xì)胞周期及增殖指數(shù)的變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，30、60、120μg/ml ART作用SMMC-7721細(xì)胞24h，細(xì)胞周期中處于G0/G1期細(xì)胞比例(分別為74.91%±0.69%、77.14%±1.39%、78.62%±0.55%)與對(duì)照組(70.60%±0.60%)比較明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖5)。120μg/ml組G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于30μg/ml ART組(P＜0.01)。30、60、120μg/ml ART作用SMMC-7721細(xì)胞24h，細(xì)胞增殖指數(shù)(分別為25.09%±0.69%、22.86%±1.39%、21.38%±0.55%)與對(duì)照組(29.40%±0.60%)比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖5)。120μg/ml ART組細(xì)胞增殖指數(shù)明顯低于30μg/ml ART組(P＜0.01)。

圖5 青蒿琥酯作用下肝癌SMMC-7721細(xì)胞周期及增殖指數(shù) (流式細(xì)胞術(shù)，n=3)Fig.5 Cell cycle and proliferation index of SMMC-7721 cells after treatment with artesunate (Flow cytometry, n=3)

2.6 青蒿琥酯作用下SMMC-7721細(xì)胞Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)水平 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，30、60、120μg/ml ART作用SMMC-7721細(xì)胞24h，Bcl-2蛋白表達(dá)量(分別為220.86±7.76、195.64±9.23、148.32±8.19)與對(duì)照組中Bcl-2蛋白表達(dá)量(256.86±7.78)比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且具有青蒿琥酯劑量依賴性。Bax蛋白表達(dá)量(分別為214.22±2.01、231.54±6.16、260.96±11.38)與對(duì)照組(186.21±8.82)比較明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，亦具有青蒿琥酯劑量依賴性(圖6)。

3 討 論

肝癌是我國(guó)較常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病及病死率較高，預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅了人們的生命健康。肝癌死亡率居全國(guó)惡性腫瘤死亡率的第2位，發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位[1]。目前，肝癌的綜合治療包括手術(shù)、介入治療、放化療等，但治療效果不佳，5年生存率仍然很低[2]。尋找高效低毒的抗肝癌藥物顯得格外重要。中藥治療腫瘤具有悠久的歷史，具有低毒副作用、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。目前已有較多的腫瘤研究學(xué)者從中草藥中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物，已有大量的研究顯示多種中草藥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用[15]。青蒿琥酯是我國(guó)經(jīng)典的抗瘧藥物，尤其對(duì)于重型及耐藥型瘧疾具有較好的療效[16-17]。進(jìn)一步研究顯示，青蒿琥酯除了抗瘧作用外，還具有抗腫瘤活性，對(duì)多種腫瘤具有生長(zhǎng)抑制作用[18-19]。本課題組在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯對(duì)食管癌及胃癌具有生長(zhǎng)抑制作用，其作用機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[11-13]。但青蒿琥酯在肝癌中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究青蒿琥酯對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及其相關(guān)機(jī)制，為青蒿琥酯作為廣譜的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖6 青蒿琥酯作用下肝癌SMMC-7721細(xì)胞Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù)，n=3)Fig.6 Expressions of Bcl-2 and Bax protein in SMMC-7721 cells after treatment with artesunate (Flow cytometry, n=3)

本研究應(yīng)用不同濃度青蒿琥酯作用肝癌SMMC-7721細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)是否具有抑制作用，結(jié)果顯示，青蒿琥酯對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用且具有濃度依賴性。檢測(cè)到青蒿琥酯作用SMMC-7721細(xì)胞24h的IC50為60.27±1.51μg/ml，依據(jù)此IC50濃度選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)的3個(gè)青蒿琥酯濃度，分別為30、60、120μg/ml。

惡性腫瘤具有旺盛的增殖能力，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡紊亂在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，因此調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡可以起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。不同濃度青蒿琥酯作用肝癌SMMC-7721細(xì)胞24h后，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度死亡，形態(tài)變得更不規(guī)則，顯示青蒿琥酯對(duì)SMMC-7721細(xì)胞具有殺傷作用，與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯作用后，SMMC-7721細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的凋亡，且具有青蒿琥酯劑量依賴性，推測(cè)青蒿琥酯對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的殺傷作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。線粒體膜電位是內(nèi)源性凋亡途徑的關(guān)鍵因素，線粒體膜電位的降低可引起不可逆性凋亡發(fā)生。線粒體膜電位降低可引起細(xì)胞色素C等釋放，釋放的細(xì)胞色素C可以活化caspase蛋白酶家族，引起細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程。本研究檢測(cè)到青蒿琥酯作用后引起SMMC-7721細(xì)胞線粒體膜電位的降低，且具有劑量依賴性。

B淋巴細(xì)胞瘤-2基因簡(jiǎn)稱Bcl-2(B-cell lymphoma-2)，是細(xì)胞凋亡研究中最受關(guān)注的調(diào)控因子。Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞線粒體膜電位水平有關(guān)。細(xì)胞色素C作為呼吸鏈中重要的電子傳遞體，它從線粒體內(nèi)膜上的釋放會(huì)阻斷電子向下游傳遞，危及呼吸鏈的功能并導(dǎo)致超氧陰離子的加速產(chǎn)生，從而導(dǎo)致一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起不可逆性的細(xì)胞凋亡。Bcl-2可以抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2以線粒體作為靶細(xì)胞器，Bcl-2蛋白C端的疏水肽段能插入線粒體外膜，有大量的Bcl-2位于線粒體內(nèi)外膜的接觸位點(diǎn)，高表達(dá)Bcl-2能防止線粒體膜電位的耗散，穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。Bax是Bcl-2家族中促凋亡因子，Bcl-2可與促凋亡因子Bax形成二聚體，如果Bax相對(duì)量高于Bcl-2，則Bax同二聚體的數(shù)量增多，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；如果Bcl-2相對(duì)量高于Bax，則促進(jìn)形成Bcl-2/Bax異二聚體，并使Bcl-2同二聚體數(shù)量增多，則抑制細(xì)胞凋亡。本文中檢測(cè)到青蒿琥酯作用后SMMC-7721細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)水平升高，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果一致。

綜上，青蒿琥酯對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，且呈劑量依賴性，其作用機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。青蒿琥酯可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)水平從而引起線粒體膜電位的降低，引起細(xì)胞凋亡。青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，來(lái)源于植物黃花蒿，黃花蒿產(chǎn)于我國(guó)，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，如果能將青蒿琥酯開(kāi)發(fā)為廣譜的抗腫瘤藥物，將會(huì)具有廣泛的應(yīng)用前景。