任 璐，王瑩鈺，楊 沫，蔡天嬌，雷宏杰*

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

啤酒高濃釀造技術主要應用于低濃度啤酒和高輔料啤酒的生產(chǎn)，現(xiàn)已成為一項成熟的工藝并被廣泛應用于淡爽型啤酒釀造中[1]。國內(nèi)外知名啤酒釀造企業(yè)如青島啤酒、百威啤酒等都已成功運用了啤酒高濃釀造技術，并充分發(fā)揮了該技術所帶來的優(yōu)勢：在投資和運行成本較低的情況下，增加產(chǎn)量50%～100%[2-3]。然而，麥汁濃度過高會帶來很多生產(chǎn)上的問題，如發(fā)酵時間的延長、麥汁發(fā)酵度和酵母絮凝性的降低[4-5]、啤酒風味和泡沫穩(wěn)定性變差等[6-7]，主要原因是高濃麥汁導致酵母細胞需要承受更大的環(huán)境脅迫，如高滲透壓和高乙醇毒性，均對酵母細胞產(chǎn)生一定的毒害作用[8]。而且，發(fā)酵后期營養(yǎng)物質匱乏，尤其是溶氧水平和可同化氮源的降低，致使環(huán)境脅迫作用更加嚴重[9-10]。

氮源作為酵母細胞生長和代謝所必需的元素之一，在酵母生長、繁殖過程中扮演著非常重要的角色。維持較高水平的游離氨基氮（free amino nitrogen，F(xiàn)AN）可改善酵母細胞的生長率和發(fā)酵度[11]，而麥汁濃度的升高可導致細胞對氨基酸的吸收速率下降[12-13]。氨基酸作為重要的可同化氮源不僅參與細胞內(nèi)各物質的代謝[13]，并能提高啤酒非生物穩(wěn)定性，而且部分氨基酸還可調控啤酒酵母細胞適應高滲透壓和高乙醇毒性，從而提高酵母的發(fā)酵性能。對于能夠改善啤酒酵母發(fā)酵性能的關鍵氨基酸的確定還存在較大爭論，相關研究也甚少。Lekkas等[14]認為Lys和Met是啤酒釀造過程中的關鍵氨基酸，可提高酵母的發(fā)酵性能，而Mas等[15]的研究結果表明Met抑制了酵母細胞的生長；Lei Hongjie等[16]發(fā)現(xiàn)Lys和His能夠促進酵母細胞生長、提高麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量。這些矛盾的研究結果可能是由發(fā)酵條件的差異和酵母菌種特異性引起的。

本研究的前期工作表明：在不同的環(huán)境脅迫條件下（高滲透壓和高乙醇毒性），酵母對8種氨基酸（Met、Phe、Trp、Arg、His、Ile、Leu、Lys）的同化與發(fā)酵性能（麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量）之間呈現(xiàn)顯著正相關性（P＜0.05），表明這8 種氨基酸可能有助于啤酒酵母適應高濃釀造過程中的環(huán)境脅迫。因此，本研究目的是驗證這8 種氨基酸在啤酒高濃釀造中對酵母發(fā)酵性能的改善作用，為啤酒高濃釀造中優(yōu)質氮源的選擇提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原料

Lager啤酒酵母Saccharomyces pastorianus，由西北農(nóng)林科技大學食品工程實驗室提供。該菌種經(jīng)紫外照射和甲基磺酸乙酯復合誘變后在含有高濃度麥芽糖和乙醇的培養(yǎng)基上進行馴化培養(yǎng)獲得。

澳麥芽 廈門市老啤匠貿(mào)易有限公司；酒花顆粒西安雪花啤酒有限公司。

1.1.2 試劑

果糖 厚樸生物科技（蘇州）有限公司；亞甲基藍 南京化學試劑股份有限公司；無水乙醇、氯化鈉、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DYJX型-80 ℃冰箱 鼎耀機械有限公司；UV1780紫外-可見分光光度計 日本島津公司；TS-1102C小型立式恒溫振蕩箱 上海天呈實驗儀器制有限公司；XP6電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；860型粉碎機 南京威利朗是食品機械有限公司；E100LED MV生物顯微鏡 日本尼康公司；BSD-150搖床培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；ATAGO糖度計廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；YX-280高壓滅菌鍋江陰濱江醫(yī)療設備廠；CM-5色差計 科電貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麥汁制備

稱取一定量的澳麥芽，經(jīng)粉碎機粉碎后裝入糖化鍋內(nèi)，按照麥芽與水的質量比為1∶4加入45 ℃釀造水，攪拌均勻，用乳酸調至pH 5.5。設置升溫程序依次為：45 ℃，30 min；63 ℃，60 min；72 ℃，10 min；78 ℃，10 min。以1 ℃/min的速率升溫，開始糖化，糖化結束后迅速冷卻至45 ℃進行濾布過濾，再將濾液煮沸90 min，煮沸過程中分3 次添加酒花顆粒，添加量為麥芽質量的0.2%。煮沸結束后再次用紗布過濾，得到澄清麥汁。將澄清的麥汁用釀造水定型至12 °P，然后添加麥芽糖漿提高麥汁濃度至24 °P。發(fā)酵前進行121 ℃、15 min高壓蒸汽滅菌。

1.3.2 酵母種子擴培和啤酒發(fā)酵

在無菌條件下，用接種環(huán)從試管斜面上刮取一環(huán)酵母，接種于10 mL 12 °P全麥芽麥汁種子培養(yǎng)液中，25 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，之后轉入200 mL 12 °P全麥芽麥汁種子液中，20 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)48 h，最后轉入1 L種子液中，15 ℃靜置培養(yǎng)72 h。8 000×g、4 ℃離心10 min取酵母泥，接種量5×106個細胞/mL。

采用2 L錐形瓶進行啤酒發(fā)酵，裝液量為1.0 L的24 °P無菌麥汁，接種酵母之前在發(fā)酵錐形瓶中添加8 種氨基酸混和物（Met、Phe、Trp、Arg、His、Ile、Leu、Lys），氨基酸的比例按照常濃12 °P麥汁中的相應氨基酸比例計算（Met 79 mg/L、Phe 300 mg/L、Trp 148 mg/L、Arg 381 mg/L、His 209 mg/L、Ile 183 mg/L、Leu 412 mg/L、Lys 192 mg/L），對照組中未添加氨基酸，在其他實驗組中氨基酸混合物的添加量分別是原麥汁這8 種氨基酸混合物（12 °P全麥芽麥汁）的0.5、1、2 倍。發(fā)酵溫度為15 ℃。每天定時取樣，發(fā)酵液和酵母菌體經(jīng)8 000×g、4 ℃離心15 min，將上清液置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 酵母細胞計數(shù)和活細胞率測定

采用血球計數(shù)板計數(shù)法測定懸浮酵母細胞數(shù)量和活細胞率（亞甲基藍染色）。將從錐形瓶中取出的樣液稀釋10 倍后測定其懸浮細胞數(shù)和活細胞率。在0.1 mL細胞懸浮液中加入0.9 mL磷酸鹽亞甲基藍溶液（pH 4.6），振蕩混勻，10 min后在電子顯微鏡下通過血球計數(shù)板對活細胞和死細胞（死亡的細胞被染成了藍色）進行計數(shù)。

1.3.4 麥汁濃度和乙醇體積分數(shù)測定

將發(fā)酵后的麥汁8 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液30 mL，倒入25 mL的附溫比重瓶中，將附溫比重瓶置于20 ℃水浴中，待溫度升到20 ℃，快速取出，稱其質量，測定其在20 ℃條件下的浸出物含量。麥汁濃度用°P表示，即100 mL麥汁中含有浸出物的固形物質量（g）。

將發(fā)酵后的麥汁離心取上清液50 mL，倒入500 mL蒸餾瓶中，再加入50 mL去離子水，加熱蒸餾。用50 mL的容量瓶收集餾出液，當餾出液體積接近50 mL時，停止蒸餾，用蒸餾水定容至50 mL。用附溫比重瓶測定其在20 ℃條件下的乙醇體積分數(shù)。

1.3.5 麥汁FAN測定

對麥汁中的FAN水平測定采用茚三酮顯色法[17]。制備Gly標準溶液（0、80、100、120、140、160 μmol/L），繪制標準曲線。麥汁樣品稀釋100 倍，首先在具塞玻璃試管中加入2.0 mL的稀釋樣品，然后加入1.0 mL的顯色劑（0.5 g茚三酮、10.0 g Na2HPO4·12H2O、6.0 g KH2PO4和0.3 g果糖溶于100 mL去離子水，pH 6.7）；再將試管放進100 ℃沸水浴中，使其精確反應16 min，然后20 ℃恒溫水浴下冷卻20 min，待冷卻完成后加入5.0 mL的稀釋劑（2.0 g KIO3溶于1 L的40%乙醇溶液），用旋渦振蕩器混勻，靜置15 min；最后在波長570 nm條件下檢測樣品吸光度。計算公式如式（1）所示：

1.3.6 啤酒色值測定

首先制備待測樣品，將發(fā)酵后的啤酒樣品稀釋至青島純生啤酒的乙醇體積分數(shù)，再將色差儀經(jīng)黑板和蒸餾水矯正后，置待測樣品于透明比色皿中進行檢測，獲得L*、a*、b*值，經(jīng)式（2）計算得到與成品啤酒的色差ΔE。

1.3.7 麥汁發(fā)酵度的計算

麥汁發(fā)酵度是啤酒發(fā)酵過程中麥汁固形物被酵母消耗的百分數(shù)。計算如式（3）所示：

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個數(shù)據(jù)均為3 次測定的平均值，采用Minitab 16進行數(shù)據(jù)分析，結果以 ±s表示，多重比較采用Tukey法，顯著水平P值小于0.05。

2 結果與分析

2.1 不同氨基酸添加倍數(shù)對啤酒高濃釀造過程中酵母生長的影響

圖1 24 °P高濃條件下對照組麥汁與添加氨基酸麥汁發(fā)酵過程中的懸浮酵母細胞數(shù)（A）和活細胞率（B）Fig.1 Number of suspended yeast cells (A) and cell viability (B) in the control group and malt wort with addition of amino acids during 24 °P high gravity fermentation

由圖1A可知，在發(fā)酵前2 d，懸浮酵母數(shù)快速增多，與對照組相比，添加氨基酸的高濃麥汁中懸浮酵母細胞數(shù)增加顯著。在發(fā)酵的第2天懸浮細胞數(shù)達到最多，對照組與添加0.5、1、2 倍氨基酸實驗組中的懸浮酵母凈生長量分別是1.73×107、2.90×107、3.23×107、2.40×107個/mL，結果表明，氨基酸的添加顯著提高了酵母的凈生長量，削弱了發(fā)酵初期高滲透壓對酵母生長的抑制作用。這是因為氨基酸可調控酵母細胞適應高滲透壓環(huán)境，并刺激了細胞的繁殖。而且在發(fā)酵初期階段（前3 d），添加1 倍氨基酸的高濃麥汁中懸浮酵母細胞數(shù)保持最多，可見氮源濃度過低和過高都不利于酵母細胞的生長繁殖，這是因為低氮源水平會降低酵母生長速率并影響細胞繁殖[18]，而高濃度氮源則激活了酵母胞內(nèi)的氮分解代謝物阻遏效應，不利于酵母對氮源的同化[19-21]，從而影響酵母的生長繁殖。酵母絮凝性是啤酒酵母的一個重要特性，在生產(chǎn)過程中絮凝性的強弱不僅可控制啤酒的發(fā)酵周期、過濾性能等，而且會對啤酒的風味產(chǎn)生影響[22]。主發(fā)酵溫度一定時，原麥汁濃度對酵母絮凝性影響較大，原麥汁濃度越高，酵母絮凝性越低[4]。氮源水平對發(fā)酵后期酵母的絮凝性能影響也較大，與對照組相比，氨基酸的添加可引起細胞絮凝性有所降低。氨基酸的添加對發(fā)酵末期酵母活細胞率也產(chǎn)生了顯著的影響（圖1B），在發(fā)酵第6天后，對照組高濃麥汁中活細胞率快速降低，而添加氨基酸的高濃麥汁中活細胞率下降較為平緩。在發(fā)酵結束時，對照組的活細胞率較低（≤86%），而添加氨基酸的實驗組活細胞率仍保持較高（≥91%）。可見，8 種氨基酸可調控酵母細胞適應高滲透壓和高乙醇毒性環(huán)境，保證了酵母細胞在高濃釀造過程中具有較高的細胞活力。

2.2 不同氨基酸添加倍數(shù)對麥汁發(fā)酵度的影響

在氮缺乏的情況下，細胞中的蛋白質及ATP含量較低，對釀酒酵母的發(fā)酵能力產(chǎn)生抑制作用，而氮源的添加可顯著加快發(fā)酵速率，改善酵母發(fā)酵能力，增加CO2釋放量[19]。如圖2所示，與對照組的發(fā)酵度相比（80%），添加0.5、1、2 倍氨基酸均可顯著提高麥汁發(fā)酵度，分別為84%、85%和82%（P＜0.05）。導致對照組麥汁發(fā)酵度較低的原因為低氮源水平抑制了酵母細胞生長及發(fā)酵性能[23]；添加0.5 倍和1 倍氨基酸的麥汁發(fā)酵度之間沒有顯著性差異（P＞0.05），而添加2 倍氨基酸的麥汁發(fā)酵度顯著降低（P＜0.05），這是因為高濃度氮源導致了酵母細胞內(nèi)氮代謝物阻遏效應的發(fā)生，影響了細胞對氮源的吸收和利用[24-27]，從而降低了酵母的發(fā)酵性能。

圖2 24 °P高濃條件下對照組麥汁與添加氨基酸組麥汁的發(fā)酵度Fig.2 Fermentability of the control group and malt wort with addition of amino acids under 24 °P high gravity

2.3 不同氨基酸添加倍數(shù)對乙醇產(chǎn)量的影響

乙醇產(chǎn)量是描述發(fā)酵程度的一個重要指標，在相同濃度麥汁的發(fā)酵體系中，F(xiàn)AN水平的提高可提高麥汁發(fā)酵度，發(fā)酵度與乙醇產(chǎn)量成正比[28]。如圖3所示，高濃麥汁中氨基酸的補充可顯著增加乙醇產(chǎn)量（P＜0.05），且添加1 倍氨基酸的麥汁發(fā)酵得到乙醇產(chǎn)量最多，為13.56%；與對照組相比，添加0.5、1、2 倍氨基酸的麥汁發(fā)酵最終乙醇產(chǎn)量分別提高了13%、17%、12%，表明氨基酸的補充可有效改善酵母的代謝，提高細胞的乙醇耐受性。啤酒高濃釀造中，高氮源水平導致乙醇產(chǎn)量下降的原因可能是氮源過高會造成酵母菌生長過于旺盛，過多的糖被用于細胞的增殖，反而不利于乙醇的積累[26]，另一方面高濃度氮源會影響氮代謝途徑，反而削弱了酵母對氮的吸收，降低了乙醇產(chǎn)量[19-21]。

圖3 24 °P高濃條件下對照組麥汁與添加氨基酸麥汁的乙醇產(chǎn)量Fig.3 Ethanol production of the control group and malt wort with addition of amino acids under 24 °P high gravity

2.4 不同氨基酸添加倍數(shù)對FAN消耗的影響

圖4 24 °P高濃條件下對照組麥汁與添加氨基酸麥汁中的FAN消耗Fig.4 Free amino nitrogen (FAN) consumption of the control group and malt wort with addition of amino acids under 24 °P high gravity

由圖4可知，麥汁中添加氨基酸顯著增加了酵母對FAN的消耗，可見麥汁中氮源的缺乏是造成高濃釀造發(fā)酵度降低的主要原因。對照組和添加0.5、1、2 倍氨基酸組麥汁發(fā)酵中總的FAN消耗量分別為448、551、637、514 mg/L，具有顯著差異（P＜0.05）。其與細胞生長速率和麥汁發(fā)酵度之間有顯著的正相關性[29]。添加1 倍氨基酸的麥汁發(fā)酵過程中酵母對FAN的消耗量最多，從而顯著提高了麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量。

2.5 不同氨基酸添加倍數(shù)對啤酒色值的影響

一般常用European Brewery Convention（EBC）比色計法表示啤酒的色度，此方法必須通過肉眼觀察色片與啤酒的顏色，這對操作者對顏色的觀察能力和敏感程度有較高的要求，由于操作人員之間對顏色的敏感程度不同，結果必然存在差異[30]。本實驗通過色差儀測定樣品的L*、a*、b*值，不僅可準確定位到一個三維立體點上的色值，不受人感官的局限，還可通過色差ΔE進行對照樣品與被測樣品之間的比較。

表1 稀釋至正常飲用啤酒乙醇體積分數(shù)后的啤酒色值Table1 Beer color values after dilution to normal alcohol for consumption

在本實驗中，高濃釀造啤酒經(jīng)釀造水稀釋至市售啤酒乙醇體積分數(shù)后，與商品啤酒中較暢銷的青島純生啤酒相比較（表1），添加氨基酸高濃釀造稀釋后的啤酒色澤依然鮮亮，與青島純生啤酒相比，L*值無顯著性差異（P＞0.05），a*值差異顯著（P＜0.05）；而未添加氨基酸高濃釀造稀釋后的啤酒與青島純生啤酒相比，L*、a*、b*分別差異顯著（P＜0.05）。這可能與多酚類物質氧化、酵母對氨基酸代謝等有關[31]。添加1 倍氨基酸釀造而成的啤酒經(jīng)稀釋后ΔE最小，說明其與對照組青島純生啤酒的色澤差異最小。

3 結 論

啤酒高濃釀造中8 種氨基酸的補充可顯著提高麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量，促進酵母生長并維持酵母活細胞率，且8 種氨基酸混合物的最適添加量為1 倍。與對照組相比，添加1 倍氨基酸混合物的高濃麥汁發(fā)酵中，發(fā)酵度提高了6%，乙醇產(chǎn)量提高了17%。添加氨基酸混合物的高濃麥汁發(fā)酵而成的啤酒稀釋至乙醇體積分數(shù)與青島純生啤酒一致時，啤酒的色澤依然鮮亮，其中添加1 倍氨基酸高濃釀造而成的啤酒經(jīng)稀釋后ΔE最小，色澤最接近青島純生啤酒。本研究為啤酒高濃釀造工業(yè)化生產(chǎn)中優(yōu)質氮源的選擇提供理論依據(jù)和方法指導。8 種氨基酸分別對啤酒酵母發(fā)酵性能的影響，以及8 種氨基酸之間的相互作用將成為下一步的重點研究內(nèi)容。