賈志麗, 齊真真, 高恩軍

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)學(xué)院 遼寧省無機(jī)分子基化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

合成藥物與生命大分子的靶類作用機(jī)制是藥物活性評(píng)價(jià)的手段[1].一般認(rèn)為 DNA 是藥物的主要靶點(diǎn).由于 DNA 是一種重要的細(xì)胞受體,合成藥物切割 DNA 和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡在致癌和癌癥治療中都起著重要作用[2-3].過渡金屬配合物可以調(diào)節(jié)對(duì) DNA 結(jié)合和切割能力,Ni(Ⅱ)配合物已經(jīng)被提出用作潛在的抗癌和抑癌劑[4].在癌癥治療領(lǐng)域,順鉑及其衍生物是使用最廣泛的金屬基藥物.但是有一些缺點(diǎn),如一般毒性,非特異性靶向和獲得性耐藥.在新興的研究領(lǐng)域,結(jié)構(gòu)的合成方面,如高功能的金屬藥物引起了人們極大的關(guān)注.本文合成了 Ni(Ⅱ)與剛性氮配位,配體 1,4-bis(1-imidazoly)benzene(1,4-二咪唑基苯,用 L示之)和 CO2協(xié)同配位的混合聚合物,即[Ni(L)2(CO2)]n.應(yīng)用光譜技術(shù)、電泳技術(shù)、細(xì)胞凋亡手段等研究了聚合物與 DNA 的作用機(jī)制和對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制效果,并得出有價(jià)值的科學(xué)信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)選材

所有試劑均為A.R級(jí). pBR322質(zhì)粒DNA和FS-DNA(魚精DNA)購(gòu)自北京華美生物技術(shù)有限公司.HeLa細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞瘤珠儲(chǔ)存和CO2細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到測(cè)定狀態(tài).元素分析(C,H和N)使用Finnigan EA 1112儀器.Perkin-Elmer LS55熒光分光光度計(jì)上測(cè)量熒光值.SOPTOP XD-RFL熒光顯微鏡進(jìn)行成像研究.

1.2 配合物的合成

準(zhǔn)確稱取硝酸鎳(0.072 g)和1,4-二咪唑基苯(0.025 g)放入裝有12 mL[V(DMF)∶V(H2O)=1∶2]溶劑的聚四氟乙烯反應(yīng)釜中,用0.05 mol/L HNO3調(diào)節(jié)pH值為5.6,室溫條件下反應(yīng)2 h,空氣中的二氧化碳被氧化.置入呈梯度升溫的150 ℃的烘箱中,恒溫加熱72 h后取出,自然冷卻至室溫.形成淡綠色晶體顆粒.收率:59.8 %.元素分析[理論值(實(shí)測(cè)值),w/%]:C,37.00(37.01);H,4.18(4.17);N,12.33(12.31).

2 結(jié)構(gòu)分析

通過單晶X-射線衍射掃描,得出該配位聚合物在空間呈八面體結(jié)構(gòu),如圖1所示.晶體結(jié)構(gòu)中主要的鍵長(zhǎng)(λ/nm)如下:Ni(1)—O(1):2.068;Ni(1)—O(2):4.154;Ni(1)—N(1):2.122;Ni(1)—N(3):2.127;主要的鍵角[θ/(°)] 如下:O(1)—Ni(1)—N(3)#3:87.251;O(1)#3—Ni(1)—N(1)#3:92.75;O(1)—Ni(1)—N(3):89.57;N(1)#3—Ni(1)—N(3):92.58;N(1)#3—Ni(1)—N(3)#3:87.42;O(1)—Ni(1)—N(3)#3:90.43.圖2是配位原子之間通過配位鍵相互協(xié)調(diào)所得一維鏈狀結(jié)構(gòu)圖.圖3是配位聚合物的π-π相互作用結(jié)構(gòu)圖.

圖1 配位聚合物配位結(jié)構(gòu)Fig.1 Coordination polymer monomer structure

圖2 配位聚合物一維鏈狀結(jié)構(gòu)Fig.2 Coordination polymer one-dimensional chain structure

圖3 配位聚合物二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)Fig.3 Coordinationpolymer two-dimensional network structure

3 細(xì)胞毒性研究

3.1 熒光光譜

溴化乙錠(EtBr)是一種常用的 DNA 熒光探針,是共軛芳香環(huán)的平面分子,這種共軛分子可以平行地嵌入 DNA 雙鏈的配位堿基對(duì)之間,形成堆積.EtBr本身有微弱的熒光,而 DNA分子沒有熒光,當(dāng) EtBr 插入 DNA 分子之后,EtBr 分子可以平行地固定在 DNA 分子內(nèi)部,從而使其分子平面剛性增加,碰撞猝滅減小,熒光顯著增強(qiáng)[5-6]. 在 DNA/EtBr 復(fù)合物中,EtBr 發(fā)出的熒光比游離 EtBr 發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍[6].當(dāng) EtBr 從雙螺旋中游離出來或雙螺旋結(jié)構(gòu)減少時(shí),熒光會(huì)明顯下降,所以當(dāng)有其他分子也能嵌入 DNA 堿基對(duì)之間時(shí),將會(huì)與 EtBr 競(jìng)爭(zhēng) DNA,EtBr 將被從 DNA / EtBr復(fù)合物中擠出,而 DNA/EtBr 體系的熒光產(chǎn)生猝滅.因此,EtBr 可作為 DNA 結(jié)構(gòu)的熒光探針[7-9]. 根據(jù)經(jīng)典斯特恩方程[8-9]:I0/I= 1 +Ksqr,其中:I,I0分別代表存在和不存在配位聚合物時(shí)的熒光強(qiáng)度；Ksq表示斯特恩猝滅常數(shù),定性描述配位聚合物與 DNA 的作用強(qiáng)弱；r代表配位聚合物與 DNA 的濃度比[9].從圖 4 可以看出配位聚合物對(duì) DNA/EtBr 系統(tǒng)產(chǎn)生了影響.以526 nm 作為激發(fā)波長(zhǎng),DNA/EtBr 復(fù)合物的熒光發(fā)射峰處于 613 nm 處.隨著配合物濃度的增加熒光強(qiáng)度逐漸減弱同時(shí)伴隨不同程度的熒光猝滅,此現(xiàn)象表明配合物與DNA發(fā)生插入作用.從圖5可以看出配合物的猝滅常數(shù)Ksq=0.254,說明配合物與DNA發(fā)生了插入作用.

(聚合物)=0 mol·L-1 2.c(聚合物)=0.5×10-6 mol·L-1 3.c(聚合物)=1.0×10-6 mol·L-1 4.c(聚合物)=1.5×10-6 mol·L-1 5.c(聚合物)=2.0×10-6 mol·L-1 6.c(聚合物)=2.5×10-6 mol·L-1 7.c(聚合物)=3.0×10-6 mol·L-1 8.c(聚合物)=3.5×10-6 mol·L-1

圖5 配位聚合物的猝滅常數(shù)Fig.5 Quenching constant of coordination polymer

3.2 凝膠電泳

帶電顆粒在電場(chǎng)作用下,向著與其電性相反的電極移動(dòng),稱為電泳[6].以瓊脂糖為介質(zhì)的凝膠電泳是測(cè)定金屬配合物對(duì) DNA 發(fā)生切割或嵌入、解旋作用的重要實(shí)驗(yàn)方法.通過電泳進(jìn)行環(huán)狀質(zhì)粒 DNA 切割時(shí),超螺旋形式(Form Ⅰ)將觀察到最快的遷移.如果一條鏈斷裂,則超螺旋帶將產(chǎn)生較慢移動(dòng)的帶切口的圓形(Form Ⅱ).如果兩條鏈都裂開,將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)線性形式(Form Ⅲ),它們?cè)趦烧咧g遷移.圖 6 是配位聚合物對(duì) pBR322 質(zhì)粒 DNA切割效果圖.對(duì)于沒有金屬配合物的對(duì)照,觀察到少量 DNA 切割(泳道 0).當(dāng)復(fù)合物在1.25 μmol/L 濃度下可以誘導(dǎo)質(zhì)粒 DNA 明顯的裂解,隨著復(fù)合物濃度的增加(泳道 1～3),pBR322 DNA 的 Form Ⅰ 的量逐漸減少,而 Form Ⅱ 逐漸增加,說明配位聚合物對(duì)質(zhì)粒DNA具有一定的切割作用與熒光效果相一致.

圖6 配位聚合物切割質(zhì)粒pBR322 DNA效果圖Fig.6 Coordination polymer cutting plasmid pBR322 DNA renderings

3.3 配合物對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)凋亡研究

細(xì)胞凋亡是最常見的基因控制過程,在組織穩(wěn)態(tài)和消除不需要的細(xì)胞中發(fā)揮重要作用,而不影響正常和未受影響的細(xì)胞凋亡[10].細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡,是指細(xì)胞在一定的生理和病理?xiàng)l件下,遵循自身的程序,自己結(jié)束其生命的過程[11].細(xì)胞凋亡不同于細(xì)胞壞死,是程序性死亡過程的一種主要形式,強(qiáng)調(diào)的是形態(tài)學(xué)上的改變[12-14].為了觀察配位聚合物對(duì)HeLa 的影響,將 HeLa 細(xì)胞在載玻片上生長(zhǎng)至體積分?jǐn)?shù)為70 %匯合.聚合物加入到培養(yǎng)基中,在 37 ℃下培養(yǎng) 12 h.用 Annexin V-FITC 和 PI 染色凋亡的和活的 HeLa 細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察圖像,結(jié)果如圖 7 所示.由圖7可以看出，癌細(xì)胞明顯發(fā)生改變.

圖7 配位聚合物對(duì)HeLa細(xì)胞作用12 h后效果Fig.7 Effect of coordination polymer on HeLa cells for 12 h

4 結(jié) 論

(1) 用配體 1,4-bis(1-inidazoly)benzene(L 示之)與金屬鎳鹽反應(yīng)制得的配位聚合物[Ni(L)2(CO2)2]n呈八面體構(gòu)型.4 個(gè) 1,4-bis(1-inidazoly)benzene 配體中咪唑環(huán)上的 N 原子和 CO2上的氧原子與中心原子 Ni 配位,該分子存在穿過 Ni(Ⅱ)的中心對(duì)稱,形成規(guī)則的八面體結(jié)構(gòu).

(2) 通過熒光譜圖和凝膠電泳可知配位聚合物[Ni(L)2(CO2)2]n與 DNA 之間以插入作用方式存在,同時(shí)對(duì) DNA有切割作用.通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究,配合物在一定程度上可以引起 HeLa癌細(xì)胞程序性死亡.