莊帝錢(qián) 梁翠瓊 趙芳

手足口病是兒科常見(jiàn)的流行性傳染病, 尤以腸道病毒EV71感染最多, 除伴發(fā)低熱、皮疹等手足口病常見(jiàn)臨床表現(xiàn)外, 易導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷, 病死率較高［1］。但目前對(duì)于手足口病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未闡明。既往研究顯示, 多種病毒性感染疾病進(jìn)展都有細(xì)胞免疫系統(tǒng)的參與, 免疫細(xì)胞的異常激活與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)［2］。對(duì)于EV71型手足口病, T淋巴細(xì)胞在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。本研究通過(guò)比較不同臨床分期EV71型手足口病患兒的外周血T淋巴細(xì)胞活化水平, 以期探討EV71型手足口病患兒外周血T淋巴細(xì)胞活化狀態(tài)與病情進(jìn)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年6月~2017年6月本院感染科收治的經(jīng)RT-PCR定性法檢測(cè)糞便呈 EV71病毒核酸陽(yáng)性的手足口病患兒140例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部手足口病防治指南(2010版)關(guān)于手足口病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］；②年齡6個(gè)月~6歲；③患兒受試前需征得家長(zhǎng)同意, 并由患兒家長(zhǎng)簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒等感染者；②合并結(jié)核、腫瘤等引起免疫異常的疾病者；③近期應(yīng)用免疫抑制劑或免疫增強(qiáng)劑者；④合并嚴(yán)重心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全者。140例手足口病患兒依照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部(現(xiàn)衛(wèi)計(jì)委)腸道病毒EV71型感染重癥病例臨床救治專(zhuān)家共識(shí)(2011版)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)［4］將其分為普通病例組(60例)、重型病例組(45例)、危重型病例組(35例)。選取同期門(mén)診健康體檢兒童50例為對(duì)照組, 均符合條件如下：①年齡6個(gè)月~6歲；②體檢結(jié)果均正常, 無(wú)心、肝、肺、腎等重要臟器疾?。虎劢跓o(wú)呼吸道、消化道等感染病史；④無(wú)手足口病等傳染病接觸史。普通病例組男34例, 女26例,年齡7個(gè)月~5歲, 平均年齡(2.75±1.03)歲；重癥病例組男23例, 女22例, 年齡6個(gè)月~5歲, 平均年齡(2.71±1.09)歲；危重癥病例組男19例, 女16例, 年齡9個(gè)月~6歲, 平均年齡(2.83±1.05)歲；對(duì)照組男25例, 女25例, 年齡1~6歲,平均年齡(2.78±1.07)歲。四組研究對(duì)象性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法 所有兒童均于清晨空腹取肘靜脈血 2 ml, 置于含有肝素鈉抗凝管內(nèi), 顛倒混勻, 并于6 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè), 對(duì)于無(wú)法6 h內(nèi)檢測(cè)樣本, 于4℃保存?zhèn)錂z。取肝素化外周全血100 μl置于專(zhuān)用試管內(nèi), 加入CD8-FITC/CD3-PerCP/CD4-APC、HLA-DR-PerCD/CD4-ADC /CD8-FITC 或CD38-PerCD/CD4-ADC/CD8-FITC, 每種抗體加10 μl, 震蕩混勻后室溫避光孵育20 min, 加入溶血素溶血處理10 min,1500 r/min離心5 min收集細(xì)胞, PBS洗滌并重懸細(xì)胞, 上機(jī)檢測(cè), 每個(gè)樣本至少收集1×104個(gè)細(xì)胞。流式細(xì)胞儀采用美國(guó)BD公司 FACS Calibur 流式細(xì)胞儀進(jìn)行, 相應(yīng)熒光標(biāo)記單克隆抗體均由自美國(guó)BD公司生產(chǎn), 并采用Cell Quest軟件收集并分析T淋巴細(xì)胞亞群分布及其活化狀態(tài)。

1. 3 觀察指標(biāo) 比較四組研究對(duì)象外周血T淋巴細(xì)胞亞群分布情況及T淋巴細(xì)胞活化狀態(tài), 分析手足口病病情進(jìn)展與T淋巴細(xì)胞活化的相關(guān)性。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 四組研究對(duì)象外周血T淋巴細(xì)胞亞群分布情況比較EV71型手足口病患兒各組外周血CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+比值顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；普通病例組患兒外周血CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+比值明顯高于重型病例組及危重型病例組(P＜0.05)；重型病例組外周血CD3+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及CD4+/ CD8+比值明顯高于危重型病例組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2. 2 四組研究對(duì)象T淋巴細(xì)胞活化狀態(tài)比較 EV71型手足 口 病 患 兒 各 組 HLA-DR+CD4+、HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+、CD38+CD8+活化亞群百分比顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；普 通 病 例 組 患 兒 HLA-DR+CD4+、HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+、CD38+CD8+活化亞群百分比明顯低于危重型病例組,且重型病例組HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亞群百分比明顯低于危重型病例組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；普通病例組患兒HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亞群百分比明顯低于重型病例組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 四組研究對(duì)象外周血T淋巴細(xì)胞亞群分布情況比較( ±s)

表1 四組研究對(duì)象外周血T淋巴細(xì)胞亞群分布情況比較( ±s)

注：與對(duì)照組比較, aP＜0.05；與重型病例組比較, bP＜0.05；與危重型病例組比較, cP＜0.05

組別 例數(shù) CD3+T淋巴細(xì)胞(%) CD4+T淋巴細(xì)胞(%) CD8+T淋巴細(xì)胞(%) CD4+/CD8+普通病例組 60 59.50±9.72abc 29.65±8.67abc 22.07±10.81abc 1.32±0.16abc重型病例組 45 44.72±10.62ac 21.55±7.43a 17.93±6.35ac 1.20±0.18ac危重型病例組 35 38.40±7.46a 19.54±5.44a 14.76±5.03a 1.07±0.22a對(duì)照組 50 68.95±8.34 44.69±10.56 27.05±8.12 1.65±0.23

表2 四組研究對(duì)象T淋巴細(xì)胞活化狀態(tài)比較( ±s, %)

表2 四組研究對(duì)象T淋巴細(xì)胞活化狀態(tài)比較( ±s, %)

注：與對(duì)照組比較, aP＜0.05；與重型病例組比較, bP＜0.05；與危重型病例組比較, cP＜0.05

組別 例數(shù) HLA-DR+CD4+ HLA-DR+CD8+ CD38+CD4+ CD38+CD8+普通病例組 60 18.64±4.76abc 17.70±4.96ac 7.75±2.33ac 53.84±10.62abc重型病例組 45 28.12±5.63ac 18.97±4.72a 8.74±3.41a 68.75±8.93ac危重型病例組 35 33.42±6.04a 20.34±4.55a 9.65±3.76a 74.60±7.86a對(duì)照組 50 7.45±2.67 12.58±5.43 5.59±2.36 27.35±5.76

2. 3 手足口病病情進(jìn)展與T淋巴細(xì)胞活化的相關(guān)性分析經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亞群百分比與手足口病病情進(jìn)展呈極強(qiáng)正相關(guān)(r=0.878、0.867,P＜0.05), HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+活化亞群百分比與手足口病病情進(jìn)展呈中等程度正相關(guān)(r=0.415、0.525,P＜0.05)。見(jiàn)表 3。

表3 手足口病病情進(jìn)展與T淋巴細(xì)胞活化的相關(guān)性分析

3 討論

目前, EV71已取代柯薩奇病毒A16型(CoxA16)成為手足口病的主要致病病原體, 占到手足口病總發(fā)病人數(shù)的80%以上［5］。EV71感染后主要在腸道內(nèi)復(fù)制, 患兒表現(xiàn)出發(fā)熱、皰疹樣皮損等癥狀, 隨著病毒感染的進(jìn)程, 患兒開(kāi)始出現(xiàn)腦干腦炎、無(wú)菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥, 手足口病重癥化, 進(jìn)一步發(fā)展, 可能出現(xiàn)肺水腫等呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥以及神經(jīng)系統(tǒng)的永久性損傷, 最終導(dǎo)致患兒死亡［6-8］。但目前對(duì)于EV71型手足口病的發(fā)病機(jī)制尚不明確,臨床仍缺乏特異、高效的抗病毒藥物。因此, 探討EV71型手足口病發(fā)生、發(fā)展的影響因素, 對(duì)重癥病例提供早期預(yù)警指標(biāo)及新的治療方向具有重要意義。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 感染EV71后T淋巴細(xì)胞數(shù)量缺乏的小鼠更易發(fā)展為重癥病例［9］, 提示細(xì)胞免疫系統(tǒng)在手足口病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)于小兒而言, 天然免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟, 其免疫機(jī)制以T淋巴細(xì)胞為主。按照細(xì)胞表面抗原差異, T淋巴細(xì)胞分為CD4+、CD8+細(xì)胞亞群, 其中CD4+T細(xì)胞為免疫輔助性細(xì)胞, 促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫；CD8+T細(xì)胞為細(xì)胞毒性細(xì)胞或抑制性細(xì)胞, 抑制免疫反應(yīng),二者的動(dòng)態(tài)平衡共同維持機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定［10,11］。本研究結(jié)果顯示, EV71型手足口病患兒各組外周血CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+比值顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；普通病例組患兒外周血CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及CD4+/ CD8+比值明顯高于重型病例組及危重型病例組(P＜0.05)；重型病例組外周血CD3+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及CD4+/ CD8+比值明顯高于危重型病例組(P＜0.05)。提示手足口病患兒存在細(xì)胞免疫功能下降且存在免疫紊亂。

既往研究顯示, 在人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒、乙型肝炎病毒(HBV)等多種病毒感染時(shí)均出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞異?；罨? 且其與病毒載量間呈正相關(guān)［12,13］。這提示手足口病患兒也可能存在T淋巴細(xì)胞的異?；罨?。HLA-DR和CD38是T淋巴細(xì)胞活化的標(biāo)志物。HLA-DR是人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體MHC-Ⅱ類(lèi)分子的抗原之一, 用于病原體有效抗原成分的提呈, 從而激活T淋巴細(xì)胞［14］。CD38是一類(lèi)單鏈跨膜糖蛋白, 與T淋巴細(xì)胞協(xié)同刺激信號(hào)的傳遞及誘導(dǎo)特定細(xì)胞因子的生成有關(guān), 從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的激活［15］。本研究結(jié)果顯示, EV71型手足口病患兒各組HLADR+CD4+、HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+、CD38+CD8+活 化亞群百分比顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；普通病例組及重型病例 組 患 兒 HLA-DR+CD4+、HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+、CD38+CD8+活化亞群百分比明顯低于危重型病例組, 且HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亞群百分比明顯低于重型病例組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；重型病例組患兒HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亞群百分比明顯低于危重型病例組(P＜0.05)。表明EV71感染可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的激活。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), HLA-DR+CD4+、CD38+CD8+活化亞群百分比與手足口病病情進(jìn)展呈極強(qiáng)正相關(guān)(r=0.878、0.867,P＜0.05), HLA-DR+CD8+、CD38+CD4+活化亞群百分比與手足口病病情進(jìn)展呈中等程度正相關(guān)(r=0.415、0.525,P＜0.05)。提示T淋巴細(xì)胞的活化與EV71型手足口病的病情進(jìn)展密切相關(guān)。此外, 活化的T淋巴細(xì)胞高表達(dá)Fas/FasL, 促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡, 也解釋手足口病患兒T淋巴細(xì)胞數(shù)量的降低［14］。

綜上所述, EV71型手足口病患兒外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少, 但其活化程度增加, 且活化程度與病情進(jìn)展密切相關(guān)。因此, 通過(guò)對(duì)EV71型手足口病患兒外周血T淋巴細(xì)胞激活亞群的檢測(cè), 能夠判斷疾病進(jìn)展情況, 從而指導(dǎo)臨床治療, 改善患兒預(yù)后。