唐銘鈺， 李 錦， 趙瑞柯， 陶 悅， 曹 清

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.2 方法

1.2.1 FilmArray檢測 采集所有病例的鼻咽拭子或痰標(biāo)本于30 min內(nèi)送至檢驗室，將試劑緩沖液和標(biāo)本混合液注入測試條插入FilmArray檢測系統(tǒng)（生物梅里埃公司生產(chǎn)）中鑒定。FilmArray檢測系統(tǒng)可全面檢測20種病原體：腺病毒、冠狀病毒229E、冠狀病毒HKU1、冠狀病毒NL63、冠狀病毒OC43、人類偏肺病毒、人鼻病毒/腸病毒、甲型流感病毒（H1亞型、H1-2009亞型、H3亞型）、乙型流感病毒、副流感病毒（1型、2型、3型、4型）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、肺炎衣原體、肺炎支原體、百日咳鮑特菌。

1.2.2 季節(jié)劃分 根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境分別劃分四季時間，春季為3－5月、夏季為6－8月、秋季為9－11月、冬季為12月－次年2月。分析呼吸道病原與天氣特征的關(guān)聯(lián)作用。

選取本院2016年12月－2017年11月收治入院的6歲以下急性喘息性疾病患兒259例，其中男161例，女98例，所有患兒均符合喘息性疾病診斷條件，即臨床診斷參照《實用兒科學(xué)》和肺部聽診聞及哮鳴音2項標(biāo)準(zhǔn)，采集患兒鼻咽拭子或痰標(biāo)本。

收集患兒的年齡、性別、發(fā)病季節(jié)、臨床癥狀、病程、臨床診斷、肝腎功能、心肌酶譜、痰培養(yǎng)、X線胸片等資料。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件包，正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）或均數(shù)表示。組間比較采用t檢驗或秩和檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，樣本間率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

2016年12月1日－2017年11月30日收治入院的6歲以下急性喘息性疾病患兒259例。其中男161例（62.2%），女98例（37.8%），男女比為1.6∶1。發(fā)病年齡1月齡～5歲，平均（1.22±1.20）歲，其中151例（58.3%）＜1歲，75例（29.0%）為1～2歲，33例（12.7%）為3～5歲。存在基礎(chǔ)疾病者89例（34.4%），其中先天性心臟病61例（68.5%，61/89），早產(chǎn)兒14例（15.7%，14/89），均排除氣道狹窄或軟化等因素引起的喘息發(fā)作。

2.2 FilmArray檢測系統(tǒng)病原菌檢出結(jié)果

259例標(biāo)本中檢出單一病原陽性樣本130例，檢出2種及2種以上混合病原陽性樣本99例，陽性總檢出率88.4%（229/259），30例樣本未檢出病原，陰性率為11.6%（30/259）。其中，單一病原中RSV檢出率最高，為15.4%（40/259），其次為鼻病毒/腸病毒12.4%（32/259），副流感病毒3型6.9%（18/259），肺炎支原體、人偏肺病毒及腺病毒檢出率均為3.5%（9/259）。見圖1。

259例樣本中2種及以上病原陽性樣本檢出99例，陽性檢出率為38.2%。其中76例標(biāo)本檢出2種病原，20例標(biāo)本檢出3種病原，3例標(biāo)本檢出4種病原。以鼻病毒/腸病毒的陽性檢出率最高，為46.5%（46/99），見圖2，且混合感染中以鼻病毒 /腸病毒混合副流感病毒3型檢出率最高，達(dá)9.1%（9/99）。見表1。

2.3 不同季節(jié)感染患兒病原學(xué)分布

病毒感染具有明顯的季節(jié)性，RSV感染多發(fā)生在秋冬季（χ2=28.787，P＜0.001），腺病毒感染多發(fā)生在冬季（χ2=32.706，P＜0.001），副流感病毒3型多發(fā)生在春夏季（χ2=30.312，P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

圖1 FilmArray檢測系統(tǒng)病原檢測情況Figure 1 Pathogen detection by FilmArray BioSurveillance System

2.5 單病原與混合病原感染的喘息患兒臨床特征比較

根據(jù)FilmArray檢測將259例急性喘息性疾病患兒分為單病原感染和混合感染2組，單病原組130例，混合病原組99例。2組患兒臨床特征比較，混合感染組年齡偏小，發(fā)熱時間延長，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而重癥疾病、并發(fā)癥（肝功能損害、呼吸衰竭、心肌損害等）、合并細(xì)菌感染、混合感染與單病原感染組無差異，但混合病原感染組患兒喘息天數(shù)明顯多于單病原感染組（Z=-2.698，P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

圖2 混合感染中病原分布情況Figure 2 Distribution of pathogens in mixed infections

3 討論

喘息是兒童常見的呼吸道臨床癥狀之一。研究認(rèn)為，約1/3兒童在3歲前至少有一次喘息發(fā)作[5]。國內(nèi)外調(diào)查顯示，呼吸道病毒感染是誘發(fā)兒童喘息最常見的致病原因，常見的病毒有RSV、鼻病毒等，其中RSV感染為首要病原[6-7]。在本次研究中259例患兒經(jīng)檢測后感染率達(dá)88.4%，其中RSV為急性喘息性疾病感染的首要病原，其次為鼻病毒，其后為副流感病毒3型。RSV屬于副黏病毒科，國外研究顯示RSV是2歲以前兒童喘息及隨后發(fā)生持續(xù)喘息的主要感染病毒，長期隨訪研究顯示，至5歲時曾患RSV毛細(xì)支氣管炎的兒童中有40%有喘息，而對照組僅11%有喘息[8]。RSV毛細(xì)支氣管炎和對遠(yuǎn)期兒童哮喘發(fā)生的影響與毛細(xì)支氣管炎嚴(yán)重度和個體易感性有關(guān)[9]。人鼻病毒屬于小RNA病毒科，Kotaniemi-Syrjanen等[10]報道2歲內(nèi)因鼻病毒感染喘息住院的嬰幼兒與其他病毒感染如RSV相比，其發(fā)生哮喘的風(fēng)險高出4倍。這些數(shù)據(jù)表明，鼻病毒感染后發(fā)生兒童哮喘的風(fēng)險比RSV感染更高。副流感病毒在1950年第1次被發(fā)現(xiàn)描述，屬副黏病毒科，其中副流感病毒3型是感染率最高的亞型，是僅次于RSV的引起呼吸道感染暴發(fā)流行的主要病原之一，易引起肺炎及嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎[11]。

肺炎支原體是兒童時期常見的非典型病原體，肺炎支原體通過直接毒素作用及免疫功能紊亂等氣道炎癥及氣道高反應(yīng)導(dǎo)致患兒出現(xiàn)喘息[12]，可以誘發(fā)喘息或使原有病情惡化[13]。Biscardi等[14]通過血清學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，既往已確診哮喘的兒童急性發(fā)作時，肺炎支原體檢測陽性率為20%；而既往無哮喘病史的兒童，首次急性喘息時，肺炎支原體檢測陽性率為50%，即半數(shù)兒童首次喘息發(fā)作發(fā)生于肺炎支原體感染的過程，且這些兒童大多數(shù)具有個人或家族過敏史等哮喘發(fā)生危險因素，提示肺炎支原體感染不僅與喘息發(fā)作和控制不良相關(guān)，而且可能參與了喘息的啟動過程。Principi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體肺炎在兒童社區(qū)獲得性肺炎中所占比例隨年齡增長而增加，2～4歲、5～7歲和＞7 歲患兒中通過血清學(xué)抗體檢測陽性率分別為20.4%、37.8%和53.8%，而PCR檢測則分別為14.8%、26.2%和41.9%。有文獻(xiàn)報道FilmArray檢測肺炎支原體陽性率為8.1%[16]，而本研究中陽性率為9.6%，大致相仿，考慮可能由于受檢對象的年齡導(dǎo)致。人體感染肺炎支原體后能產(chǎn)生特異性IgM、IgA及IgG類抗體，恢復(fù)期和急性期肺炎支原體抗體滴度呈4倍或4倍以上增高或減低時，可確診為肺炎支原體感染[17]。由于臨床上較難實現(xiàn)雙份血清檢測，多采用單份血清結(jié)果來判斷是否存在肺炎支原體感染，這往往不能真實地反映患兒感染情況，也可能由于既往感染所致。PCR是診斷肺炎支原體感染的重要方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，且不受感染時間限制，也不受患兒免疫功能的影響。

表1 人鼻病毒/腸病毒相關(guān)的混合感染情況Table 1 The prevalence of pathogens in human rhinovirus/enterovirus-positive infections(n=99)

表2 呼吸道病原在急性喘息性疾病患兒中的季節(jié)分布Table 2 Seasonal distribution of respiratory pathogens in children with acute wheezing disorders[n（%）]

表3 單病原與混合病原感染的患兒臨床特征比較Table 3 Clinical features of children with acute wheezing disorder in terms of number of pathogens

本研究中發(fā)現(xiàn)感染百日咳鮑特菌的患兒亦發(fā)生喘息，其中單感染百日咳鮑特菌患兒為4例，均小于5月齡。國外研究 發(fā)現(xiàn)患百日咳的嬰兒中18.08%可表現(xiàn)為喘息[18]，考慮可能與支氣管及肺泡周圍粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集形成間質(zhì)炎癥有關(guān)。本研究中尚有11.6%患兒檢測結(jié)果為陰性，可能由引起呼吸道感染的其他病原體感染而引發(fā)，由于FilmArray檢測病毒及非典型性病原體類型局限，而并未檢測出。

在呼吸道病原學(xué)研究中，多種病原體混合感染多有報道，國外Olofsson等[19]、Bierbaum等[20]分別利用多重反轉(zhuǎn)錄PCR及多重PCR基因芯片方法檢測混合感染報道的陽性率為10%、8.7% 。本研究中2種及以上病原陽性檢出率為38.2%高于已有報道，可能與選取的檢測方法有關(guān)。FilmArray呼吸道檢測系統(tǒng)是經(jīng)美國及歐洲FDA認(rèn)證的多重巢式PCR系統(tǒng)，該系統(tǒng)集樣品制備、擴(kuò)增、檢測和分析功能于一體，其呼吸道測試條1次可完成多種病原檢測，國外臨床研究報道，該系統(tǒng)綜合靈敏度為95%、特異度為99%，其檢出結(jié)果與病原培養(yǎng)檢測結(jié)果一致[21-23]。本研究混合感染中，以人鼻病毒的陽性檢出率最高，為46.5%，其他依次為副流感病毒3型和RSV，分別為40.4%（40/99）和39.4%（39/99）。目前，關(guān)于人鼻病毒與呼吸道常見病毒的混合感染研究較多，其中人鼻病毒、RSV以及副流感病毒的混合感染被認(rèn)為是最主要的呼吸道疾病病因[24-25]，與本研究結(jié)果相符，這是由于先后感染或隱性攜帶或其他原因不得而知。有學(xué)者認(rèn)為，人鼻病毒可在呼吸道中持續(xù)較長時間，導(dǎo)致過度檢出[26]。關(guān)于人鼻病毒混合感染是否增加疾病的嚴(yán)重程度或其對預(yù)后的影響目前仍尚有爭議，需進(jìn)一步觀察研究[24]。

呼吸道病毒流行常有一定季節(jié)性，溫帶地區(qū)冬、春季常是呼吸道病毒活躍的季節(jié)。RSV的流行季節(jié)有明顯的氣候分布特征，在溫帶地區(qū)和大部分亞熱帶地區(qū)，RSV的流行出現(xiàn)在每年的晚秋、整個冬季和春季。在中國大部分地區(qū)，RSV相關(guān)疾病流行高峰在1、2月份。2006年至2009年，Zhang等[27]收集分析894例急性呼吸道感染兒童的鼻咽分泌物發(fā)現(xiàn)，RSV的流行季節(jié)主要集中在11月份至次年3月份。本研究中，RSV的感染多在秋冬季，明顯高于夏季。在我國南方，人鼻病毒導(dǎo)致的呼吸道感染可常年發(fā)生，感染高峰集中在春、秋季。在北方人鼻病毒高發(fā)流行季節(jié)主要是冬、春兩季。但本研究發(fā)現(xiàn)以秋季人鼻病毒檢出率最高，明顯高于其他三季。不同季節(jié)兒童感染副流感病毒的情況有所不同，1型及3型春夏季的感染率高于秋冬2個季節(jié)。本研究中，副流感病毒3型多發(fā)生在春夏季，與常州地區(qū)和南京地區(qū)的流行時間一致[28]，可能是由于同為長江中下游地區(qū)，春夏季節(jié)雨水多，濕度大，溫度增高，高溫潮濕的氣候更易使副流感病毒形成大的氣溶膠，能夠在空氣中更長時間存活傳播。

多種混合感染在臨床中較為常見，但產(chǎn)生的原因及其對臨床的影響尚有不同的結(jié)果。Aberle等[29]的研究表明，混合病毒感染患兒更易出現(xiàn)發(fā)熱、低氧血癥且住院時間更長 。也有學(xué)者報道了雙重呼吸道病毒混合感染較單一病毒感染收住兒科ICU的風(fēng)險增高3倍[30]。但也有部分研究結(jié)果顯示，混合感染與疾病嚴(yán)重程度無相關(guān)性[31]。Calvo等[32]一項為期3年的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，混合病毒感染組與單一病毒感染組相比無明顯臨床差異 。本研究發(fā)現(xiàn)，混合感染組年齡、發(fā)熱時間、混合細(xì)菌感染率與單病原感染組差異不明顯，喘息時間混合感染明顯長于單病原感染組（P=0.007），但病情嚴(yán)重程度并無差異。

綜上所述，本研究顯示6歲以下兒童急性喘息性疾病病原主要為呼吸道病毒感染，且混合感染多見。如能在喘息性呼吸道疾病發(fā)病的初期進(jìn)行病原學(xué)的快速檢測，明確病原體感染，對臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義，可以避免不必要的抗生素應(yīng)用，減少患兒的藥費開支及耐藥菌的產(chǎn)生。FilmArray檢測系統(tǒng)具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點，在65 min內(nèi)可檢測20種病原體，對于疾病的早期診斷、針對性的治療、抗生素的合理應(yīng)用和控制，具有很大的輔助作用，但其病原檢測范圍未覆蓋博卡病毒、軍團(tuán)菌以及大部分細(xì)菌等病原，在臨床應(yīng)用中需要與其他檢測手段互為補(bǔ) 充。