杜芳玲， 王蓮慧， 魏丹丹， 萬臘根， 張 偉， 劉 洋

自從20世紀(jì)80年代中期，在我國臺灣地區(qū)社區(qū)獲得性肝膿腫患者中發(fā)現(xiàn)，高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）新型變種已經(jīng)成為了一種世界性的感染疾病病原體[1-3]。與經(jīng)典的肺炎克雷伯菌（nonhvKP）感染不同的是，hvKP菌株不僅可以引起免疫力低下患者的醫(yī)院感染，還可以引起免疫力正?；颊呱鐓^(qū)獲得性的嚴(yán)重感染。hvKP菌株的另外一個典型特征是它具備從原始感染部位向身體其他組織器官侵襲的能力，導(dǎo)致遠(yuǎn)端組織器官的感染，即遷徙性感染的發(fā)生[4]，這在革蘭陰性桿菌引起的感染中很少見，其具體致病機(jī)制至今不 明。

目前已發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞在hvKP菌株的遷徙性播散中發(fā)揮重要作用。以往研究表明誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡不僅與細(xì)菌的毒力有關(guān)，還可能涉及病原體免疫逃逸及宿主體內(nèi)生存[5]，故了解hvKP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡異常對闡明其致病性有重要意義。核因子-κB（NF-κB）作為一個重要的核因子，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。本研究旨在分析hvKP菌株誘導(dǎo)人外周血中性粒細(xì)胞凋亡及對NF-κB的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

hvKP菌株Kp1500分離自臨床肝膿腫患者。患者表現(xiàn)出遷徙性播散感染，并參照相關(guān)文獻(xiàn)[6]對其高黏表型（拉絲試驗陽性）和高毒力基因型（K1莢膜血清分型及攜帶 pLVPK毒力質(zhì)粒 ）進(jìn)行了相關(guān)確認(rèn)[7]。肺炎克雷伯菌ATCC 700603（屬K6血清莢膜分型）為non-hvKP菌株，作為對照菌株。

1.2 細(xì)胞株來源和培養(yǎng)

人中性粒細(xì)胞分離自我院健康體檢志愿者，采用含10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640（GIBCO）培養(yǎng)液在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3 檢測方法

1.3.1 細(xì)胞凋亡檢測 ①感染患者體內(nèi)中性粒細(xì)胞凋亡檢測：抽取hvKP和non-hvKP感染患者外周血3～5 mL，提取外周血中性粒細(xì)胞37 ℃條件下分別孵育0、3、6、9 h后檢測細(xì)胞凋亡情況；②體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡檢測：提取健康體檢志愿者外周血中性粒細(xì)胞。將hvKP菌株（組）和nonhvKP菌株（組）的新鮮培養(yǎng)物在15 ℃、12 000 r/min離心15 min，沉淀的菌體用無抗生素的2% FCS RPMI1640培養(yǎng)液重懸。按細(xì)菌∶細(xì)胞=10︰l的比例，將細(xì)菌懸液加于單層細(xì)胞培養(yǎng)物中，37 ℃條件下分別孵育0、3、6、9 h。凋亡檢測為：棄培養(yǎng)液，用pH7.4、0.01 mol/L滅菌PBS洗滌3次后收集細(xì)胞，按AnnexinV kit（caltag Laboratories，USA）操作說明書，采用流式細(xì)胞儀（Coulter，Epics xL，USA）檢測細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗中同時設(shè)置不加細(xì)菌的正常細(xì)胞對照組（0.9 % NaCl 溶液）。早期凋亡細(xì)胞可被FITC-Annexin V著色，但不被PI著色，晚期凋亡和壞死細(xì)胞可被2種染料同時著色，活細(xì)胞不被染料著色，各實(shí)驗組重復(fù)試驗3次。

1.3.2 中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的測定 中性粒細(xì)胞懸液中加二氫若丹明（dihydrorhodamine，DHR），37 ℃孵育2 min，加菌株刺激10 min，流式細(xì)胞儀檢測單通道5 000個細(xì)胞，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長510～550 nm，結(jié)果以平均通道熒光強(qiáng)度表示。分別檢測對照組、hvKP組及nonhvKP組的第30、95、165 min 上述指標(biāo)，各實(shí)驗組重復(fù)試驗3次。

1.3.3 Westem blot法檢測NF-кB p65 按1.3.1中②方法收集hvKP菌和non-hvKP菌并分別感染健康志愿者中性粒細(xì)胞 3、6、9 h。用pH7.4、0.01 mol/L滅菌PBS洗滌3次后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度約為106/mL。按蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞蛋白，蛋白質(zhì)變性后行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳條件為200 V。電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，制作濾紙（Whatman，3 MM CHR）-凝膠-膜“三明治”，極恒流300 mA轉(zhuǎn)移70 min，于加樣槽中加入相應(yīng)的一抗（Abcam公司）約1 mL（1∶300），室溫下于搖床孵育。用含吐溫20的磷酸緩沖鹽水（PBST）洗滌10 min，每個加樣槽中加入二抗1 mL左右，室溫下于搖床孵育1 h。用電化學(xué)發(fā)光（ECL）進(jìn)行底物化學(xué)發(fā)光，ECL試劑用前配制，暗室曝光5～30 s，照相。WB系統(tǒng)可靠性采用內(nèi)參β-actin進(jìn)行校正，內(nèi)參蛋白陽性提示提取的蛋白完整有效。WB檢測結(jié)果以Gelpro3.2凝膠光密度分析軟件處理數(shù)據(jù)，以平均光密度值（D）/內(nèi)參β-actin之比計算NF-кB p65蛋白相對表達(dá)含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件，組間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.0l表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hvKP與non-hvKP感染患者外周血中性粒細(xì)胞的凋亡率

hvKP感染患者外周血中性粒細(xì)胞，隨著時間延長，凋亡率逐漸升高，在不同時間（0、3、6、9 h）凋亡率均顯著低于non-hvKP組和對照組（P＜0.01）。而non-hvKP感染外周血中性粒細(xì)胞不同時間（0、3、6、9 h）凋亡率與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

2.2 hvKP和non-hvKP體外誘導(dǎo)外周血中性粒細(xì)胞凋亡率

hvKP體外誘導(dǎo)人外周血中性粒細(xì)胞后，隨著時間延長，凋亡率逐漸升高。hvKP誘導(dǎo)人外周血中性粒細(xì)胞不同時間（0、3、6、9 h）凋亡率均顯著低于non-hvKP組和對照組（P＜0.01）。而non-hvKP組與對照組之間則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖2。

圖1 hvKP和non-hvKP感染患者外周血中性粒細(xì)胞凋亡圖Figure 1 Apoptosis of neutrophils in patients infected with hypervirulent K. pneumoniae （hvKP） and non-hvKP strains in vitro

圖2 hvKP和non-hvKP體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡圖Figure 2 Apoptosis of neutrophils induced by hypervirulent K. pneumoniae （hvKP） and non-hvKP strains in vitro

2.3 外周血中性粒細(xì)胞NF-κBp65蛋白含量的變化

與對照組相比，hvKP組和non-hvKP組隨著時間延長NF-κB p65蛋白表達(dá)逐漸增多，且各個時間點(diǎn)（3、6、9 h）均高于對照組； 而non-hvKP組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 Western blot檢測hvKP和non-hvKP感染外周血中性粒細(xì)胞不同時間點(diǎn)時p65蛋白表達(dá)變化Figure 3 Western blots for p65 protein expression levels in human neutrophils following hvKP or non-hvKP stimulation

2.4 呼吸爆發(fā)功能差異

hvKP體外感染患者外周血中性粒細(xì)胞后，各時間點(diǎn)（0、30、95、165 min）中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)強(qiáng)度顯著低于non-hvKP組和對照組（P＜0.01）。而non-hvKP組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

3 討論

hvKP的臨床致病特點(diǎn)及細(xì)菌表型特征與傳統(tǒng)的醫(yī)院感染肺炎克雷伯菌存在較大差異[8]，前者感染嚴(yán)重，以多發(fā)性膿腫為主要特征，可引起多部位感染（如眼內(nèi)炎、腦膜炎、肝膿腫等），往往集中于健康青年患者，多為社區(qū)獲得性感染，但近年也出現(xiàn)醫(yī)院獲得性感染[9-11]。此外，hvKP多表現(xiàn)出高黏性，常攜帶magA、rmpA及產(chǎn)氣菌素等多種毒力基因，往往具備獨(dú)特的表型和基因型特征[12]。中性粒細(xì)胞為機(jī)體內(nèi)最活躍的炎性細(xì)胞，在臟器內(nèi)大量聚集、活化是導(dǎo)致相關(guān)炎癥性疾病惡化的中心環(huán)節(jié)。已有研究表明中性粒細(xì)胞或在hvKP菌感染中發(fā)揮重要作用[5]。激活的中性粒細(xì)胞可產(chǎn)生大量自由基、蛋白水解酶及炎性介質(zhì)等有害物質(zhì)造成組織損傷。適度清除中性粒細(xì)胞是控制炎癥發(fā)展的重要措施。因此，凋亡作為中性粒細(xì)胞重要的非炎性清除方式，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中具有十分重要的作用。但關(guān)于hvKP感染時，中性粒細(xì)胞的作用及轉(zhuǎn)歸，與hvKP菌感染發(fā)生發(fā)展的關(guān)系等，鮮見報道。

圖4 hvKP和non-hvKP不同時間點(diǎn)刺激外周血中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)強(qiáng)度變化Figure 4 Intracellular reactive oxygen species generation in peripheral neutrophils at different times after hvKP or nonhvKP stimulation

由于中性粒細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不具備分化、增殖能力，所以當(dāng)中性粒細(xì)胞凋亡受到抑制時，勢必導(dǎo)致其生命期限延長。以往研究顯示，中性粒細(xì)胞凋亡延遲可導(dǎo)致有毒產(chǎn)物釋放的機(jī)會相對增多，這將加重自身組織細(xì)胞損傷。呼吸爆發(fā)是中性粒細(xì)胞發(fā)揮殺菌的重要手段，呼吸爆發(fā)功能增強(qiáng)可顯著增加中性粒細(xì)胞殺菌能力[13]。然而，我們對1株hvKP研究發(fā)現(xiàn)，雖然hvKP菌株較non-hvKP在體內(nèi)外均可顯著誘導(dǎo)人外周血中性粒細(xì)胞凋亡延遲。然而，我們意外發(fā)現(xiàn)，較nonhvKP，hvKP導(dǎo)致人外周血中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)能力顯著降低，由此我們推測hvKP菌株雖然可以增強(qiáng)凋亡延遲而促進(jìn)中性粒細(xì)胞對hvKP菌株的作用及吞噬，但卻可通過抑制其呼吸爆發(fā)功能以減少中性粒細(xì)胞對hvKP菌株的損傷及殺滅，如此或可促進(jìn)hvKP菌株在中性粒細(xì)胞內(nèi)的生存，導(dǎo)致hvKP菌更易通過以中性粒細(xì)胞為載體在全身進(jìn)行播散，造成多臟器的遷徙性感染，這與Lin等[5]的研究報道一致。

已有研究表明，NF-κB具有抑制中性粒細(xì)胞凋亡的作用[14]。其可能通過中性粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，延遲中性粒細(xì)胞凋亡，從而間接加劇了炎癥狀態(tài)。p65是NF-κB二聚體（p65/p50）主要亞單位之一，代表了NF-κB的激活程度[15]。靜息狀態(tài)時，p65與KB抑制蛋白（IKB）結(jié)合，不具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的能力，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外信號刺激時，蛋白激酶被激活，IKB磷酸化并降解，從而釋放p65，使其得以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核中，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此我們推測hvKP誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡延遲的作用可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB活性從而抑制中性粒細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，hvKP感染人外周血中性粒細(xì)胞 NF-κB p65蛋白的表達(dá)逐漸增多，且NF-κB p65蛋白的表達(dá)與中性粒細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)，說明在hvKP感染時，外周血中性粒細(xì)胞NF-κB的活化可能與中性粒細(xì)胞的凋亡延遲有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)hvKP可早期通過活化NF-κB而表現(xiàn)出抑制中性粒細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞生命周期延長，從而增強(qiáng)其對hvKP的吞噬及抗感染作用。但意外的是，其卻可抑制中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞對hvKP殺滅能力下降，如此或可導(dǎo)致hvKP被中性粒細(xì)胞吞噬卻無法殺滅，最終造成其在全身播散形成遷徙性感染，具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。