王 穎，邊照陽(yáng)，鄧惠敏，楊 飛，劉珊珊，李中皓，范子彥，唐綱嶺

(國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南 鄭州 450001)

對(duì)羥基苯甲酸酯又稱為尼泊爾金酯，包括甲酯、乙酯、丙酯等，是一種廣譜、高效的防腐劑，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、藥品等領(lǐng)域[1-4]，甚至在嬰兒用品(如咬咬膠)中也有檢出[5]。對(duì)羥基苯甲酸酯具有酚羥基結(jié)構(gòu)，抑菌活性主要來(lái)自其分子態(tài)，在pH 3～8范圍內(nèi)有較好的抑菌作用[6]，實(shí)際中多為幾種酯的混合使用。尼泊爾金酯進(jìn)入人體后，大部分經(jīng)代謝排出，最初使用時(shí)對(duì)其毒性認(rèn)識(shí)并不十分明確[7]。1998年，Routledge等[8]首次發(fā)現(xiàn)了尼泊爾金酯具有雌激素活性，隨后進(jìn)行的一些暴露學(xué)實(shí)驗(yàn)也提示該類防腐劑可能與乳腺癌的發(fā)病有關(guān)[9-10]。歐盟已于2014年開(kāi)始限制部分尼泊爾金酯類物質(zhì)應(yīng)用于化妝品中[11]。不同于日用品，食品中尼泊爾金酯類物質(zhì)直接進(jìn)入人體，過(guò)多的攝入會(huì)導(dǎo)致其代謝不完全而被吸收儲(chǔ)存于人體組織中，造成多種疾病的發(fā)生。

口含煙是一種無(wú)煙氣煙草制品，主要通過(guò)口腔含服對(duì)其吸食。為了保證口感，這類產(chǎn)品的含水率較卷煙高，有的甚至加入大量的保潤(rùn)劑以保持其濕潤(rùn)狀態(tài)[12]。由于溫度較高時(shí)極易產(chǎn)生霉菌等腐敗物質(zhì)，因此，會(huì)在產(chǎn)品中加入一定量的防腐成分。目前，我國(guó)規(guī)定食品中此類防腐劑的限量為10～1 500 mg/kg(按照不同的對(duì)羥基苯甲酸酯分類，且以對(duì)羥基苯甲酸鹽計(jì))，而國(guó)際上關(guān)于口含煙成分安全監(jiān)控研究的報(bào)道較少。因此，尼泊爾金酯等防腐劑的準(zhǔn)確檢測(cè)具有重要的意義。

尼泊爾金酯類物質(zhì)的檢測(cè)方法包括毛細(xì)管電泳[13]、氣相色譜[14-15]、氣相色譜-質(zhì)譜[5,16]、液相色譜[17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[18-20]等技術(shù)。其中，氣相色譜法的檢測(cè)靈敏度較低；氣相色譜-質(zhì)譜法在測(cè)定之前需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，操作繁瑣；液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法均可實(shí)現(xiàn)尼泊爾金酯類物質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)定，但液相色譜法需要使用大量的有機(jī)溶劑，對(duì)操作者和環(huán)境的危害較大。合相色譜是2012年由Waters公司推出的全新色譜技術(shù)，其主要的流動(dòng)相為壓縮二氧化碳(CO2)，與液體流動(dòng)相或載氣相比，降低了成本和毒性，且分析速度快，與質(zhì)譜聯(lián)用可以進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。

本研究擬采用乙腈提取，超高效合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPC2-MS/MS)測(cè)定口含煙中尼泊爾金酯類物質(zhì)，希望為該類物質(zhì)的檢測(cè)提供新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Acquity UPC2Xevo超高效合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源)、Acquity UPC2 TMHSS C18 SB色譜柱(3.0 mm×100 mm×1.8 μm)、Acquity UPC2 TMBEH 2-EP色譜柱(3.0 mm×100 mm×1.7 μm)、Acquity UPC2 TMBEH色譜柱(3.0 mm×100 mm×1.7 μm)、Acquity UPC2 TMCSHTMFluoro-Phenyl色譜柱(3.0 mm×100 mm×1.7 μm)：均為美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；KQ700-DB超聲波發(fā)生器：江蘇昆山超聲儀器公司產(chǎn)品；XH-D漩渦混合器：無(wú)錫沃信儀器有限公司產(chǎn)品；Sigma 3-30 K冷凍高速離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；0.22 μm尼龍濾頭：上海安譜公司產(chǎn)品；BSA2245-CW電子天平(感量0.1 mg)：德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈：均為色譜純，美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品；對(duì)羥基苯甲酸甲酯(MPB)、對(duì)羥基苯甲酸乙酯(EPB)、對(duì)羥基苯甲酸丙酯(PPB)、對(duì)羥基苯甲酸丁酯(DPB)：純度均大于99%，上海安譜公司產(chǎn)品；氘代-對(duì)羥基苯甲酸甲酯(D4-MPB)：純度大于99%，德國(guó)Dr. EHrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品；HLB固相萃取小柱：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Sigmole EN 3008(25 mg PSA，2.5 mg GCB，150 mg MgSO4)萃取試劑盒：上?？泼鸦瘜W(xué)科技有限公司產(chǎn)品；BondElut 5982-5021(25 mg PSA，150 mg MgSO4)和BondElut 5982-5321(25 mg PSA，7.5 mg Carbon，150 mg MgSO4)萃取試劑盒：美國(guó)Agilent科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取約0.05 g MPB、EPB、PPB、DPB于燒杯中，加入乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

向2.5 mg氘代對(duì)羥基苯甲酸甲酯加入25 mL乙腈，得到100 mg/L的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.4 樣品前處理

剪開(kāi)袋裝口含煙的包裝，準(zhǔn)確稱取約1 g(精確至0.000 1 g)樣品至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，再加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲提取30 min，以10 000 r/min離心2 min。取1～1.5 mL上清液至含有QuEChERS試劑(25 mg PSA、7.5 mg Carbon、150 mg MgSO4)的離心管中，渦旋混合1～2 min，以10 000 r/min離心1 min，取上清液，過(guò)0.22 μm尼龍濾膜，待測(cè)。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPC2 TMHSS C18 SB柱(3.0 mm×100 mm×1.8 μm)；柱溫55 ℃；流動(dòng)相：A為CO2，B為異丙醇-甲醇溶液(V/V，1∶1)；流速1.5 mL/min；梯度洗脫程序：0～3.0 min(98%A)，3～3.2 min(98%～92%A)，3.2～4.0 min(92%～98%A)，4.0～5.0 min(98%A)；進(jìn)樣體積1 μL；動(dòng)態(tài)備壓1.03×107Pa；補(bǔ)償液：0.1%甲酸水溶液；流速0.2 mL/min。

1.5.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～250；離子源溫度150 ℃；毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑氣溫度400 ℃；脫溶劑氣流速600 L/h；反吹氣流速50 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。具體質(zhì)譜條件列于表1。

表1 各化合物基本信息和質(zhì)譜測(cè)定條件Table 1 Standard information of the compounds and optimized conditions of mass spectrometry

注：*表示定量離子

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

選取合相色譜最常用的4種分析柱測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果示于圖1。由圖1可知，采用UPC2 TMCSHTMFluoro-Phenyl色譜柱(圖1a)和UPC2 TMBEH 2-EP色譜柱(圖1b)無(wú)法完全分離4種成分。4種成分在UPC2 TMBEH 2-EP色譜柱上的響應(yīng)較低，靈敏度較差。采用Acquity UPC2 TMBEH色譜柱(圖1c)時(shí)，對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸乙酯無(wú)法分離。在UPC2 TMHSS C18 SB色譜柱上(圖1d)，4種成分實(shí)現(xiàn)分離，峰形對(duì)稱、尖銳，有利于定量分析。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇 UPC2 TMHSS C18 SB色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行分離。

2.2 改性劑的選擇

在合相色譜分析中，主要的流動(dòng)相為非極性超臨界CO2，通過(guò)在CO2中加入一定量的液體助劑(也稱為改性劑)，可以適當(dāng)?shù)母淖兞鲃?dòng)相性質(zhì)，從而改變其對(duì)化合物的洗脫能力，改善各化合物的峰形和分離情況。實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、異丙醇、甲醇-異丙醇(V/V，1∶1)等改性劑對(duì)分離的影響，示于圖2。結(jié)果表明，甲醇、乙腈和異丙醇不能實(shí)現(xiàn)所有成分的良好分離；而采用甲醇-異丙醇(V/V，1∶1)時(shí)，4種成分得到了較好分離。因此，本實(shí)驗(yàn)選取甲醇-異丙醇(V/V，1∶1)作為改性劑。

2.3 柱溫的選擇

超臨界流體的黏度會(huì)隨著溫度升高而降低，導(dǎo)致溶劑化能力減小，出峰延時(shí)，所以相對(duì)于液相色譜的流動(dòng)相，溫度對(duì)合相色譜的流動(dòng)相——超臨界狀態(tài)下的CO2影響更大。合相色譜柱溫的范圍一般為10～60 ℃。實(shí)驗(yàn)考察了15～60 ℃柱溫對(duì)目標(biāo)物分離的影響。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫小于55 ℃時(shí)，各化合物出峰較快，部分物質(zhì)難以分離；當(dāng)柱溫為55 ℃時(shí)，各化合物分離度較好，峰形對(duì)稱；當(dāng)柱溫繼續(xù)升高，各化合物保留時(shí)間沒(méi)有明顯提高，且分離度變化不大。因此，本實(shí)驗(yàn)選取柱溫55 ℃對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。

2.4 動(dòng)態(tài)備壓的選擇

合相色譜動(dòng)態(tài)備壓控制整個(gè)操作過(guò)程中CO2的超臨界流體狀態(tài)，是影響分離過(guò)程的重要因素之一。實(shí)驗(yàn)考察了動(dòng)態(tài)備壓在1.03×107～1.37×107Pa范圍內(nèi)對(duì)目標(biāo)物分離的影響。當(dāng)動(dòng)態(tài)備壓由1.03×107Pa逐漸上升時(shí)，各化合物分離度開(kāi)始呈緩慢下降趨勢(shì)；升至1.10×107Pa及以上時(shí)，分離度下降較快。因此，選擇動(dòng)態(tài)備壓1.03×107Pa，此時(shí)，系統(tǒng)壓力不大，4種化合物分離良好。

注：a.UPC2 TM CSHTM Fluoro-Phenyl色譜柱；b.UPC2 TM BEH 2-EP色譜柱；c.Acquity UPC2 TM BEH色譜柱；d.UPC2 TM HSS C18 SB色譜柱；1.對(duì)羥基苯甲酸甲酯；2.對(duì)羥基苯甲酸乙酯；3.對(duì)羥基苯甲酸丙酯；4.對(duì)羥基苯甲酸丁酯圖1 4種色譜柱上標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard solution on 4 kinds of column

注：a.甲醇；b.乙腈；c.異丙醇；d.甲醇-異丙醇(V/V，1∶1)圖2 改性劑的選擇對(duì)分離的影響Fig.2 Effect of the selection of modifiers on separation

2.5 萃取溶劑的選擇

對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈等有機(jī)溶劑。甲醇[20-21]和乙腈是文獻(xiàn)中常用的提取溶劑，但提取前都要加鹽，如NaCl[22]或Na2SO4[23]，這主要是因?yàn)樘穷惡偷鞍踪|(zhì)等物質(zhì)會(huì)在有機(jī)溶劑中聚集成團(tuán)，使得目標(biāo)分析物被樣品顆粒包裹，降低了提取效率?？诤瑹熤袩煵荨⒌鞍踪|(zhì)和糖類等物質(zhì)的含量均較高，并且由于制作工藝的不同，其水分和鹽的含量比普通煙草高很多。實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈對(duì)樣品的提取效率。結(jié)果表明，相較于乙醇和異丙醇，甲醇和乙腈的提取效率均較高，但是甲醇提取的樣品色素含量較高，因此，選擇乙腈為萃取溶劑。另外，實(shí)驗(yàn)考察加入Na2SO4對(duì)提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)加入Na2SO4后提取效率變化不大，這可能是因?yàn)榭诤瑹煴旧淼暮}量較高，不需外加鹽即可直接提取。

2.6 樣品凈化條件的選擇

質(zhì)譜分析中，相較于其他類型的離子源，電噴霧離子源更易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。凈化樣品可以有效地降低基質(zhì)效應(yīng)，是前處理過(guò)程的重要環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)考察了固相萃取(SPE)和QuEChERS方法對(duì)樣品的凈化效果。采用的固相萃取小柱為Thermo Fisher OnGuard RP柱、Waters Oasis HLB 柱，采用的QuEChERS萃取試劑盒為Sigmole EN 3008(25 mg PSA，2.5 mg GCB，150 mg MgSO4)、BondElut 5982-5021(25 mg PSA，150 mg MgSO4)、BondElut 5982-5321(25 mg PSA，7.5 mg Carbon，150 mg MgSO4)，結(jié)果示于圖3。由圖3可知，2種固相萃取小柱和BondElut 5982-5021試劑盒處理后的樣品回收率差別不大；采用Sigmole EN 3008試劑盒處理后的樣品回收率有所提高；當(dāng)增加QuEChERS試劑盒中碳含量，即采用BondElut 5982-5321試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行處理時(shí)，回收率較為滿意。石墨化碳主要去除樣品中色素，說(shuō)明色素類物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾較大。實(shí)驗(yàn)最終選擇BondElut 5982-5321試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1加標(biāo)回收率和精密度 選取口含煙樣品進(jìn)行低、中、高加標(biāo)水平回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量分別為50、100、200 μg/L，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。將不加標(biāo)樣品平行測(cè)定6次，計(jì)算平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果列于表2?？梢?jiàn)，低、中、高加標(biāo)水平條件下的回收率為94.6%～105.6%；4種成分6次平行測(cè)定的RSD為2.14%～3.95%。

圖3 不同凈化條件對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of different sorbents on the recoveries

2.7.2線性關(guān)系、定量限和檢出限 用乙腈稀釋1.3節(jié)中的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別配制濃度為50、80、100、200、300、500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(內(nèi)標(biāo)加入量為50 μL)。采用優(yōu)化后的UPC2-MS/MS條件進(jìn)行分析測(cè)定，以待測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以信噪比S/N=3和S/N=10計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，其線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限列于表3。

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

選取10種市售口含煙樣品，采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果示于圖4。結(jié)果表明，在多個(gè)樣品中均檢出對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑，較常見(jiàn)的是對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸乙酯的混合使用，僅在1個(gè)樣品中同時(shí)檢出4種成分。從定量角度看，所有樣品中單個(gè)成分的含量和多種成分的總含量均小于10 mg/kg，低于我國(guó)對(duì)于食品中此類防腐劑的添加限量要求。但是，鑒于歐盟對(duì)此類物質(zhì)日益嚴(yán)格的限制，今后對(duì)此類物質(zhì)的使用需持謹(jǐn)慎態(tài)度。

表2 加標(biāo)回收率Table 2 Recoveries of different compounds

表3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢出限Table 3 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of quantification (LOQs) and limits of detection (LODs)

注：a.對(duì)羥基苯甲酸甲酯；b.對(duì)羥基苯甲酸乙酯；c.對(duì)羥基苯甲酸丙酯；d.對(duì)羥基苯甲酸丁酯圖4 實(shí)際樣品的選擇性離子譜圖Fig.4 Selected ion chromatograms of real samples

3 結(jié)論

通過(guò)乙腈提取，UPC2 TMHSS C18 SB色譜柱分離，超高效合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPC2-MS/MS)定性和定量分析對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑，實(shí)現(xiàn)了口含煙中該類防腐劑的合相色譜-質(zhì)譜分析。該方法綠色、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于實(shí)際樣品的分析測(cè)定。