朱效慧,孟 琴,馮世燕

(1.山東省臨沂市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 臨沂 276000；2.臨沂醫(yī)專附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 臨沂 276000)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指育齡婦女連續(xù)2次或2次以上自然流產(chǎn)，雖然RSA的發(fā)生率不足5%，但給患者造成了極大的影響，且會(huì)隨著RSA次數(shù)的增加而增加下次流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前已知的RSA的原因有內(nèi)分泌異常、生殖道感染畸形及染色體異常等，然而仍然有50%左右的RSA未找到原因，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[2]。URSA占RSA的60%～70%，由于發(fā)病的原因不明確，治療非常困難，也無針對(duì)性的治療措施，給患者的身心和經(jīng)濟(jì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)[3-4]。因此，研究URSA的發(fā)病機(jī)制，并找到安全高效的治療方法是解決URSA的關(guān)鍵。

腫瘤蛋白P53(tumor protein P53，TP53)起初被認(rèn)為是一種抑癌基因。TP53能抑制或激活基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，避免基因發(fā)生突變。隨著對(duì)TP53研究的深入，研究[4-5]顯示：TP53在生殖中也起重要作用。研究[6-7]顯示：TP53多態(tài)性與RSA有關(guān)，若有發(fā)育毒性物質(zhì)以氧化應(yīng)激的方式起作用，TP53基因能保護(hù)胚胎發(fā)育，若發(fā)育毒性物質(zhì)以激活細(xì)胞凋亡的方式起作用，TP53基因能導(dǎo)致胚胎的異常發(fā)育。但TP53對(duì)URSA的影響及機(jī)制目前尚未清楚。鑒于TP53基因在胚胎發(fā)育方面的作用，本研究擬探討TP53在URSA絨毛組織中的表達(dá)及其對(duì)人滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，以期為后續(xù)URSA的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者組：選取2014年9月—2015年6月山東省臨沂市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的URSA患者40例，年齡21～39歲，平均年齡30.4歲，孕期42～79 d，平均孕期59.2 d；所有患者尿人絨毛膜促性腺激素(HCG)呈陽性，B超檢測(cè)均顯示為宮內(nèi)孕，無胎心音。對(duì)照組：選取同時(shí)期在山東省臨沂市人民醫(yī)院就診的實(shí)施人工流產(chǎn)的健康孕婦30例,年齡21～39歲，平均年齡29.3歲；孕期40～74 d，平均孕期49.2 d；所有研究對(duì)象尿HCG呈陽性，B超檢測(cè)均顯示為宮內(nèi)孕，有胎心，胎兒正常發(fā)育。

1.2 細(xì)胞、試劑和主要儀器 人滋養(yǎng)層HTR-8細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基和胰酶均購自美國Gibco公司，青、鏈霉素購自美國Amresco公司，熒光定量試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國ACTGene公司，Bcl-2和Bax單克隆抗體均購自美國Millipore公司，Cleaved-Caspase3單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)公司，BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERAcell型)購自美國Thermo公司，倒置熒光顯微鏡(CK2-TRC-3型)購自日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀(LSR Ⅱ)購自美國BD公司，垂直電泳槽(DYCZ-24EN)購自北京六一生物科技有限公司，128C型酶標(biāo)儀購自奧地利CliniBio公司。

1.3 樣本收集和處理 所有樣本的采集均經(jīng)過患者及家屬的知情同意。所有研究對(duì)象的絨毛組織均在無菌條件下通過負(fù)壓吸引術(shù)獲得，置于-80℃冰箱中保存。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出人滋養(yǎng)層HTR-8細(xì)胞，37℃水浴溶解，向凍存管中加入含有10%FBS、100 g·L-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。傳代3～4次調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，含10%FBS培養(yǎng)基終止消化，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105mL-1，細(xì)胞接種于96孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照美國Invitrogen 公司的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。HTR-8細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組，細(xì)胞中加入無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基；空載體組，細(xì)胞中轉(zhuǎn)染合成的無干擾作用的siRNA；TP53-siRNA組，細(xì)胞中轉(zhuǎn)染合成的靶向抑制TP53的特異性siRNA。siRNA均由廣州瑞博奧生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。取生長至對(duì)數(shù)期的HTR-8細(xì)胞，消化后接種于24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。將siRNA轉(zhuǎn)染到HTR-8細(xì)胞中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，換成含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基并觀察轉(zhuǎn)染效率，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)絨毛組織中TP53 mRNA表達(dá)水平 取絨毛組織，在加入液氮的研缽中研磨成粉末后轉(zhuǎn)入經(jīng)DEPC水處理的EP管中，按照說明書(美國Invitrogen 公司)加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的總RNA質(zhì)量，A(260)/A(280)值為1.8～2.0表明RNA純度高。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)RT-PCR法檢測(cè)的Ct值，采用2-△△ct方法計(jì)算 TP53 mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 Western blotting法檢測(cè)絨毛組織中和各組HTR-8細(xì)胞中TP53蛋白表達(dá)水平 絨毛組織在預(yù)先加入液氮的研缽中研磨成粉末，轉(zhuǎn)入已加入適量裂解液的離心管中，置于冰上裂解反應(yīng)30 min，4℃、15 000 r·min-1離心15 min，收集上清。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。上樣緩沖液與蛋白樣品充分混勻，100℃變性5 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別以1∶500稀釋的TP53作為一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。TBST清洗，ECL發(fā)光劑顯影后用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白的灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。各組HTR-8細(xì)胞中 TP53蛋白表達(dá)水平檢測(cè)方法同上。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105mL-1，取1 mL細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察到細(xì)胞貼壁生長狀態(tài)良好時(shí)，收集懸浮及貼壁細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，AnnexinⅤ-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，避光室溫孵育10 min，離心，棄上清，PI冰盒中避光孵育10 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)空白對(duì)照組和TP53-siRNA組細(xì)胞凋亡率。

1.9 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移數(shù) 取轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，接種于Transwell小室的上室，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，用棉簽輕輕拭去膜上的細(xì)胞，HE染色后在倒置顯微鏡下進(jìn)行遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×200)下侵襲至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 Western blotting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染48 h的空白對(duì)照組和TP53-siRNA組細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)提取的蛋白濃度，采用1.5中方法檢測(cè)空白對(duì)照組和TP53-siRNA組細(xì)胞中Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 2組研究對(duì)象絨毛組織中TP53 mRNA和蛋白表達(dá)水平 對(duì)照組和患者組絨毛組織中TP53 mRNA表達(dá)水平分別為1.000±0.000和3.549±0.326，蛋白表達(dá)水平分別為0.021±0.004和0.273±0.032，患者組絨毛組織中TP53 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。見圖1。

Lane 1: Control group；Lane 2:Patient group.

Fig.1 Electrophoregram of expressions of TP53 protein in villus tissue of subjects in two groups

2.2 Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后各組細(xì)胞中TP53蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后， TP53-siRNA組細(xì)胞中TP53蛋白表達(dá)水平(0.112±0.009)明顯低于空白對(duì)照組(0.387±0.012)和空載體組(0.398±0.014)(P<0.01)，空載體組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05 )。見圖2。

Lane 1: Blank control group；Lane 2: Vector group；Lane 3: TP53-siRNA group.

圖2 各組HTR-8細(xì)胞中TP53蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of TP53 expressions in HTR-8 cells in various groups

2.3 各組細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后， TP53-siRNA組細(xì)胞凋亡率(3.46%±0.56%)明顯低于空白對(duì)照組(15.38%±1.21%)(P<0.01)。見圖3。

A: Blank control group；B: TP53-siRNA group.

Fig.3 Apoptoic rates of cells in two groups detected by flow cytometry

2.4 各組細(xì)胞遷移數(shù) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后， Transwell小室檢測(cè)，空白對(duì)照組和TP53-siRNA組細(xì)胞遷移數(shù)分別為71.23±8.88和152.46±6.54，TP53-siRNA組細(xì)胞遷移數(shù)明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)。

2.5 各組細(xì)胞中Cleaved-Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，與空白對(duì)照組比較，TP53-siRNA組細(xì)胞中Cleaved-Caspase3和Bax蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見圖4和表1。

Lane 1:Blank control group;Lane 2:TP53-siRNA group.

圖4 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中Cleaved-Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of expressions of Cleaved-Caspase3,Bax, and Bcl-2 proteins detected by Western blotting method

表1 各組細(xì)胞中 Cleaved-Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平

GroupCleaved-Caspase3BaxBcl-2Blank control0.436±0.0320.372±0.0310.166±0.015TP53-siRNA 0.160±0.018? 0.141±0.017?0.415±0.036?

*P<0.01 compared with blank control group.

3 討 論

細(xì)胞凋亡與維持機(jī)體的正常生理功能及組織器官的發(fā)育有關(guān)聯(lián)，在妊娠孕卵的著床和胚胎的正常發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[8]。研究[9]顯示：滋養(yǎng)層細(xì)胞大量的凋亡可導(dǎo)致細(xì)胞侵入功能不足，可誘導(dǎo)患者絨毛組織中細(xì)胞發(fā)生凋亡，說明滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡過多可能是引起反復(fù)自然流產(chǎn)的原因。研究[10-12]顯示：TP53在生殖過程中扮演重要角色，可通過下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax的表達(dá)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，在URSA患者中TP53的表達(dá)升高，且能誘導(dǎo)人滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡。提示TP53可能與URSA有關(guān)。但目前TP53對(duì)URSA的影響及其機(jī)制尚未清楚。

本研究首先檢測(cè)了URSA患者絨毛組織中TP53的表達(dá)，結(jié)果顯示：URSA患者絨毛組織中TP53 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，與已往的研究[12]結(jié)果一致。RNA干擾技術(shù)是使特定基因表達(dá)沉默的一項(xiàng)新技術(shù)，目前在多種疾病治療、基因功能研究等方面廣泛應(yīng)用[13-14]。鑒于TP53在URSA患者絨毛組織中的高表達(dá)，本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默人滋養(yǎng)層細(xì)胞TP53表達(dá)，結(jié)果顯示：TP53受到干擾后人滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡率明顯降低，遷移能力升高，提示沉默TP53表達(dá)可降低URSA的發(fā)生率。

Caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，Caspase3是該家族關(guān)鍵成員，也是能在胎盤組織中表達(dá)的Caspase[15-16]。研究[17-18]顯示：Caspase3在URSA患者絨毛組織中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，說明Caspase3表達(dá)水平升高可能是引起流產(chǎn)的原因。Bax和Bcl-2在細(xì)胞凋亡過程中起重要的調(diào)控作用，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，Bax/Bcl-2比值升高促進(jìn)細(xì)胞凋亡，反之則抑制細(xì)胞凋亡[19]。通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比值可影響人滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示：干擾TP53表達(dá)后Cleaved-Caspase3和Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，提示干擾TP53表達(dá)對(duì)人滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制可能是通過調(diào)控Cleaved-Caspase3、Bax和Bcl-2表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，在URSA患者絨毛組織中TP53呈高表達(dá)，沉默人滋養(yǎng)層HTR-8細(xì)胞TP53表達(dá)能明顯促進(jìn)細(xì)胞遷移和抑制細(xì)胞凋亡。本研究為探討URSA患者的診療途徑提供了理論基礎(chǔ)。