夏軼超，澈力格爾， 李寶印， 文 靜， 孫靜淳， 王寧寧， 韓 冰

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130021)

臨床上由腫瘤、外傷、先天畸形和感染等造成的骨缺損不僅會(huì)影響外部的美觀和功能，而且會(huì)給患者帶來(lái)生活上的不便，甚至威脅生命。目前臨床上對(duì)于骨缺損治療的黃金標(biāo)準(zhǔn)是自體骨移植，但是自身可提供移植骨的部位有限，并且給原來(lái)健康的部位造成了損傷，給患者造成二次傷害[1]。異體骨移植由于免疫反應(yīng)，使其應(yīng)用受到了限制[2]。組織工程旨在結(jié)合細(xì)胞、生物材料及適當(dāng)?shù)纳锘瘜W(xué)因子，來(lái)引導(dǎo)新組織的形成。在理想的狀態(tài)下，支架作為載體，是組織工程中最基礎(chǔ)也是不可或缺的一部分[3]。前期研究[4]顯示：羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)與β-磷酸三鈣(Beta - tricalcium phosphate，β-TCP)組成的生物活性材料雙相磷酸鈣(biphasic calcium phosphate，BCP)，其化學(xué)組成與骨組織的無(wú)機(jī)成分相似，并解決了HA難以降解以及β-TCP降解過(guò)快的問(wèn)題，且其具有HA和β-TCP具備的骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性和生物相容性，在骨組織工程支架研究中廣泛應(yīng)用。Macchetta等[5]采用冷凍干燥技術(shù)制作出多孔BCP/CS支架，其抗壓強(qiáng)度可與松質(zhì)骨相媲美。Petit等[6]通過(guò)X射線斷層技術(shù)發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)渭傿CP支架隨著降解會(huì)使其脆性完全表現(xiàn)出來(lái)，導(dǎo)致斷裂。殼聚糖(chitosan，CS)是自然界唯一帶正電荷的天然堿性多糖，其具備可降解性、抗菌性、可塑性高并且支持細(xì)胞黏附、增殖和分化等特點(diǎn)，但其機(jī)械性能差，故不能單獨(dú)作為組織工程支架[7]。CS在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其作為創(chuàng)口愈合的敷料具有良好的效果，作為藥物緩釋控釋載體表現(xiàn)出了良好的功能，對(duì)于牙周組織再生有一定療效，最近CS在骨組織工程領(lǐng)域也受到了廣泛的關(guān)注，具備骨組織工程支架材料的潛力[8]。本文作者擬采用3D打印技術(shù)，制備出精確孔隙大小的多孔隙相互連通的立體結(jié)構(gòu)BCP支架，再使用化學(xué)方法制備CS溶液，覆蓋于BCP支架上，構(gòu)建出BCP/CS復(fù)合骨組織工程支架，觀察材料的表征、理化性質(zhì)、毒性測(cè)試及與小鼠前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)共培養(yǎng)的增殖情況，探索CS膜覆蓋于材料上對(duì)于原本材料的影響，探討其成為骨組織工程支架材料的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器HA、β-TCP和聚乙烯(PVA)(中科院上海市硅酸鹽研究所)，CS和CCK-8試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，乙酸和H-DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，F(xiàn)BS(美國(guó)Gibco公司)。三維打印機(jī)(德國(guó)弗勞恩霍夫研究所)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-RAD公司)，掃描電子顯微鏡(SEM，SSX-550，日本SHIMADZU公司)，原子力顯微鏡(AFM，德國(guó)Bruker公司)，恒溫烘干箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)

1.2 支架的制備選擇納米級(jí)HA和β-TCP粉末，質(zhì)量比為3∶7的比例混合，以可溶于水且易于脫粘的PVA為粘結(jié)劑。將上述粉末與PVA水溶液(質(zhì)量比6%)均勻混合配成可注射的膏狀物。注射針頭壓力控制在200～400 kPa，移動(dòng)速度為6 mm·s-1。根據(jù)預(yù)設(shè)的模型數(shù)據(jù)控制針頭在三維方向定向移動(dòng)分層打印，直至整個(gè)支架打印完成。模型在室溫下干燥24 h，1 100℃燒結(jié)3 h，去除支架材料中的PVA，BCP支架最終成型[9]。制備的支架為長(zhǎng)方體，高3 mm，邊長(zhǎng)10 mm，孔隙率為400 μm。將制備完成的BCP支架用乙醇浸泡超聲消毒去除雜質(zhì)，烘干備用。配置1%乙酸溶液和5%氫氧化鈉溶液備用。稱取CS粉末放入燒杯中，使其溶于1%乙酸，磁力攪拌至CS粉末完全溶解，真空干燥箱抽空氣泡后，放入BCP支架，超聲震蕩10 min使支架孔隙中的氣泡基本析出，放入真空干燥箱2 h使CS溶液中的氣泡完全消失，CS溶液附于支架上。取出后，迅速用干凈的鑷子夾取CS溶液覆蓋的BCP支架于48孔板中，放入真空干燥箱，55℃真空干燥24 h。完全干燥后取出放入燒杯，用5%氫氧化鈉溶液浸泡30 min，完全去除乙酸，蒸餾水沖洗材料至中性，完全烘干，最終制備成BCP/CS復(fù)合支架。

1.3 BCP/CS支架與BCP支架表面形態(tài)觀察采用原子力顯微鏡觀察干燥后支架表面的粗糙度。然后支架表面噴金，采用掃描電子顯微鏡觀察支架表面的微觀形態(tài)。

1.4 支架吸水率的測(cè)定支架完全烘干后質(zhì)量為W1，將干燥后的支架浸于室溫雙蒸水中24 h，取出后用濾紙吸去材料表面的水分，稱質(zhì)量為W2。吸水率(X)=(W2-W1)/W1×100% 。每組5個(gè)樣本，取平均值。

1.5 小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)選用小鼠顱骨來(lái)源的MC3T3-E1細(xì)胞系，在37℃、5%CO2的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和1%雙抗的H-DMEM。觀察細(xì)胞狀態(tài)，2 d換液1次，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%以上時(shí)，胰酶消化傳代。

1.6 支架浸提液的制備BCP/CS支架與BCP支架去離子水超聲震蕩，烘干，高壓滅菌備用。遵循國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T16886.11-1997)中醫(yī)療器械浸提方法，按照表面積/浸提介質(zhì)=3 cm2·mL-1加入H-DMEM培養(yǎng)基(10%FBS、1%雙抗)，在CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置 72 h，得到BCP/CS和BCP支架的浸提液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，制備成細(xì)胞懸液后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104mL-1，吸取100 μL加入96孔板中。放入細(xì)胞孵育箱4 h使細(xì)胞貼壁，然后取出更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為3組：BCP/CS組(BCP/CS支架浸提液)、BCP組(BCP支架浸提液)和空白組(單純培養(yǎng)基)，每組設(shè)6復(fù)孔。各組細(xì)胞在培養(yǎng)1、3和5 d后，于超凈臺(tái)中每孔加入10 μL CCK-8溶液，放回細(xì)胞孵育箱，避光孵育2 h后取出，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 mm處檢測(cè)吸光度(A)值。細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)=(實(shí)驗(yàn)組A值/空白組A值)×100%。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T16886.5-2003)對(duì)2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的RGR進(jìn)行評(píng)級(jí)：0級(jí)，RGR>100%；1級(jí)，80%

1.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)BCP/CS支架和BCP支架(分別為BCP/CS組和BCP組)經(jīng)去離子水超聲振蕩清洗，烘干，高壓蒸汽滅菌后放入48孔培養(yǎng)板中，每孔放置1件材料，空白組為單純培養(yǎng)基，每組設(shè)3復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為2×104個(gè)。分別培養(yǎng)1、3、5和7 d后終止培養(yǎng)，在超凈臺(tái)中每孔分別加入50 μL CCK-8溶液，細(xì)胞孵育箱避光孵育2 h后，每孔吸取100 μL液體至新的96孔板中，保證無(wú)氣泡后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm處檢測(cè)A值。各組細(xì)胞增殖活性以A值表示。

2 結(jié) 果

2.1 支架的結(jié)構(gòu)BCP支架和BCP/CS復(fù)合支架均為長(zhǎng)方體，支架孔隙大小均勻，孔隙間相互連通。與BCP支架比較，BCP/CS支架表面無(wú)明顯變化，燈光下可見(jiàn)表面覆蓋一層淺黃色膜。見(jiàn)圖1A和B(插頁(yè)三)。

2.2 原子力顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察支架表面粗糙度和超微結(jié)構(gòu)原子力顯微鏡觀察支架表面粗糙度：BCP支架和BCP/CS支架表面均凹凸不平，BCP支架的表面粗糙度為860 nm，BCP/CS支架的表面粗糙度為710 nm(輪廓算數(shù)平均差)。見(jiàn)圖1C和D(插頁(yè)三)。

掃描電子顯微鏡觀察支架表面超微結(jié)構(gòu)：BCP/CS支架孔隙相互連通，孔隙為250～300 μm，支架表面粗糙不平，有許多微孔，CS膜不僅覆蓋在支架的表面，并且滲入了微孔中，覆蓋于孔壁上，并且未改變其表面微孔形態(tài)(圖2)；BCP支架表面光滑，孔隙相對(duì)于BCP/CS支架較大，為350～450 μm(圖3)。

A：Bar=1 mm;B：Bar=500 μm;C：Bar=20 μm;D：Bar=5 μm.

A：Bar=1 mm; B：Bar=500 μm; C：Bar=20 μm; D：Bar=5 μm.

2.3 支架吸水率BCP支架吸水率為(32.00±2.43)%，BCP/CS支架吸水率為(37.75±2.21)%， 2組支架吸水率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)1、3和5 d時(shí)，BCP/CS支架和BCP支架毒性等級(jí)均分別為0級(jí)、1級(jí)和1級(jí)，表明BCP/CS和BCP支架均無(wú)細(xì)胞毒性。各組支架RGR值及對(duì)應(yīng)的細(xì)胞毒性等級(jí)見(jiàn)表1。

2.5 各組細(xì)胞增殖活性 將支架與細(xì)胞共培養(yǎng)1、3、5和7 d后，各組細(xì)胞增殖活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在共培養(yǎng)1 d后,BCP組和BCP/CS組的細(xì)胞增殖活性均低于空白組(P<0.05)；培養(yǎng)3 d時(shí)，BCP組和BCP/CS組的細(xì)胞增殖活性明顯低于空白組(P<0.05)；培養(yǎng)5 d后，與空白組比較，BCP/CS組細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯變化(P>0.05)，但與BCP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)7 d后，BCP/CS組細(xì)胞增殖活性明顯高于空白組和BCP組(P<0.05)，BCP組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 2組支架細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的RGR和毒性等級(jí)

Tab.1 RGR in toxicity test and toxicity grades of scaffolds in two groups

GroupRGR(η/%)(t/d)135Toxicity grade1 3 5BCP1079490011BCP/CS1089687011

表2 各組細(xì)胞增殖活性

GroupA value(t/d) 1357Blank0.236 6±0.010 50.339 0±0.031 70.413 5±0.028 40.430 6±0.176 7BCP0.229 6±0.020 6?0.263 7±0.164 8?0.368 5±0.028 6?0.413 1±0.166 6BCP/CS0.205 6±0.005 8?0.248 7±0.013 7?0.402 3±0.007 5△0.458 6±0.186 7?△

*P<0.05 compared with blank group；△P<0.05 compared with BCP group.

3 討 論

本課題組的前期研究探索出了3D打印制備HA與β-TCP支架的方法以及質(zhì)量比為3∶7的比例，同時(shí)支架的表面形態(tài)和物理化學(xué)性能均符合骨組織工程支架的要求，通過(guò)原子力顯微鏡和掃描電子顯微鏡可見(jiàn)支架具有良好的形態(tài)[10]。組織工程的出現(xiàn)使組織缺陷的治療方法進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代，醫(yī)學(xué)從治療醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)過(guò)渡到了再生醫(yī)學(xué)。在組織工程領(lǐng)域中，由于細(xì)胞與生長(zhǎng)因子都必須負(fù)載于支架上，而其復(fù)合體又要植入人體中，所以合適的支架必須符合人體的物理化學(xué)性能，并具有良好的生物相容性[11]。

3D打印技術(shù)是以計(jì)算機(jī)三維設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)，通過(guò)將材料逐層沉積并精準(zhǔn)地控制其內(nèi)部形態(tài)，形成預(yù)設(shè)的支架模型[12]。傳統(tǒng)的相分離法、粒子瀝濾法和氣體發(fā)泡法等方法具有許多優(yōu)勢(shì)。但是由于3D打印技術(shù)仍在發(fā)展之中，其對(duì)于材料的應(yīng)用還有許多的限制。BCP是骨組織工程中最常用的生物陶瓷支架之一，其化學(xué)組成與骨組織的無(wú)機(jī)成分基本相同，作為HA和β-TCP的復(fù)合物，具備兩者皆有的優(yōu)點(diǎn)包括骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，可促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖分化，而且HA和β-TCP各自降解方面的缺點(diǎn)也可通過(guò)改變其比例來(lái)精確調(diào)整[13]。CS具有良好的生物相容性、骨引導(dǎo)性和促進(jìn)骨形成能力等優(yōu)點(diǎn)[14]，因此其在組織工程等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。Abueva等[15]將預(yù)制的CS凝膠通過(guò)針孔注射與BCP粉末結(jié)合，該注射凝膠具有良好的蛋白吸附性與生物相容性，該研究結(jié)果為穩(wěn)定性病理性骨折提供了一種微創(chuàng)骨充填材料。Mooyen等[16]采用CS/膠原蛋白基質(zhì)與BCP粘合后通過(guò)冷凍干燥法制備成復(fù)合多孔支架，在體外實(shí)驗(yàn)中取得了較好的效果。

本研究采用3D打印技術(shù)制備BCP支架，覆蓋一層CS膜與其結(jié)合。BCP支架的孔徑為350～450 μm，BCP/CS支架的孔徑為250～300 μm，該結(jié)構(gòu)均可促進(jìn)組織工程中新生骨和新生血管的形成[17]；肉眼觀察2種材料孔隙之間均有良好的連通性，掃描電鏡下也證實(shí)了支架孔徑大小形態(tài)規(guī)則且連通性良好，有利于細(xì)胞在其內(nèi)部的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞及組織的長(zhǎng)入等[18]；在吸水性方面，BCP/CS支架的吸水率高于BCP支架，表明其表面的CS膜發(fā)揮了良好的親水性作用[19]。

本研究中，將BCP/CS支架和BCP支架的浸提液與細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)后，CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示：聯(lián)合培養(yǎng)后2組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差別，表明該材料具備了生物安全性；將2種支架直接與MC3T3-E1細(xì)胞共同培養(yǎng)后，在第1和3天時(shí)，BCP/CS和BCP組細(xì)胞增殖活性均明顯小于空白組，可能由于材料為多孔三維結(jié)構(gòu)，而細(xì)胞懸液接種時(shí)從孔隙中進(jìn)入孔板底部，孔板底部經(jīng)過(guò)處理有著親水性較好的表面，所以進(jìn)入底部的細(xì)胞黏附于孔板，導(dǎo)致了初始黏附在支架上的細(xì)胞數(shù)量較空白組少[20]。本研究結(jié)果顯示：與BCP組比較，從第1天開始BCP/CS組細(xì)胞增殖活性就處于較高水平，說(shuō)明材料表面的CS膜較單純BCP支架具有更好的親水性；到第5天時(shí)，BCP/CS組細(xì)胞增殖活性組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明該材料具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力；當(dāng)培養(yǎng)到第7天時(shí)，BCP/CS組和BCP組的細(xì)胞增殖活性均高于空白組，而空白組細(xì)胞增殖活性與第5天比較幾乎無(wú)增加，可能是由于孔板底部是二維結(jié)構(gòu)，細(xì)胞長(zhǎng)滿之后由于接觸抑制效應(yīng)便逐漸停止增殖，而BCP/CS組和BCP組均為三維立體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞在其表面仍可增殖；第7天時(shí)，BCP/CS組細(xì)胞增殖活性已經(jīng)明顯高于BCP組，說(shuō)明BCP/CS復(fù)合支架比單純的BCP支架更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Castilho等[13]同樣使用3D打印技術(shù)制備孔徑為300 μm的BCP支架，使用聚乳酸-乙醇酸溶液對(duì)材料處理后，增強(qiáng)了原材料的細(xì)胞增殖水平。

綜上所述，采用3D打印制備的BCP支架具備良好的三維立體結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖及營(yíng)養(yǎng)輸送。BCP支架表面覆蓋CS后減小了孔徑，增大了表面積，使其具有更好的理化性能并促進(jìn)細(xì)胞的黏附增殖。CS本身具有多種可塑性，且已作為載藥載體在臨床應(yīng)用，本研究初步驗(yàn)證BCP/CS支架在骨組織工程中的應(yīng)用潛能，為進(jìn)一步改進(jìn)支架和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)。