陳瑛波，宋 丹，吳 晉，景作磊，劉利平，姜如嬌，孫 捷，吳英杰,5

(1.大連醫(yī)科大學 重大疾病基因工程模式動物研究所，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學 基因工程模式動物國際聯(lián)合研究中心，遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學中西醫(yī)結合研究院，遼寧 大連 116044；4.吉林大學第一醫(yī)院干部病房，吉林 長春 130021; 5.西奈山醫(yī)學院內(nèi)分泌、糖尿病和骨疾病系， 紐約 100029)

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟2017年發(fā)布的第8版全球糖尿病地圖統(tǒng)計數(shù)據(jù)，截至2017年，全球有4.25億糖尿病患者，我國成年(20～79歲)糖尿病患病人數(shù)達到1.14億，占世界糖尿病患者的25%，預計到2045年，全球?qū)薪?億糖尿病患者[1]。2型糖尿病由胰島素抵抗和胰島β細胞的功能受損導致，隨著糖尿病的進展，會出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥[2]，如何預防和治療糖尿病成為我國乃至全球的重大衛(wèi)生問題之一。中醫(yī)將糖尿病的多飲、多食、多尿和身體消瘦的“三多一少”癥狀稱之為“消渴癥”，其病機為陰虛為本、燥熱為標。中藥除了使用經(jīng)方作為糖尿病的治療藥物之外，部分單味的中藥或中藥提取物也可用于治療糖尿病?，F(xiàn)代藥理學研究[3]表明：中藥鐵皮石斛的主要藥理成分包括多糖、石斛堿、氨基酸和微量元素等。研究[4]表明：鐵皮石斛對高糖、高脂及低劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠有明顯的降糖作用，但其具體機制尚不明確。本研究將采用瘦型的糖尿病模型MKR小鼠(mouse over-expressing a dominant-negative human IGF-1 receptor specifically in muscle)和MIN6胰島瘤細胞，探討中藥鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum，DC)對小鼠胰島素抵抗的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器 12只SPF級FVBN小鼠和12只同背景SPF級MKR小鼠，購自大連醫(yī)科大學基因工程模式動物研究所SPF動物中心；飼養(yǎng)條件：溫度21℃～23℃，相對濕度30%～60%，12 h照明/黑暗交替的環(huán)境。小鼠胰島瘤MIN6細胞由上海第二軍醫(yī)大學章衛(wèi)平教授贈送。

鐵皮石斛干品，廣東省東莞市睿紳生物技術有限公司；二甲雙胍(metformin , Met)，TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；葡萄糖，美國Sigma Aldrich公司；胰島素，萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR檢測試劑盒，北京全式金生物技術有限公司；Trizol，寶生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基和3種抗生素(青霉素/鏈霉素/兩性霉素B)混合液，美國Gibco公司；胎牛血清， 美國GEMINI公司；胰島素ELISA試劑盒，武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；兔抗鼠蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和磷酸肌醇3激酶(PI3K)單克隆抗體，美國CST公司；兔抗鼠磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K)、胰島素受體底物1(IRS1)、磷酸化胰島素受體底物1(p-IRS1)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)和糖原合成酶激酶(GSK3β)單克隆抗體，美國Abcam公司；凋亡檢測試劑盒，美國Thermo-Fisher Scientific公司。血糖試紙和血糖儀，瑞士Roche公司。

1.2 純合子MKR小鼠的獲得 利用F0代雜合子小鼠雜交獲得F1代，F(xiàn)1代小鼠與WT小鼠進行雜交產(chǎn)生F2代，通過F2代的基因型鑒定確定F1代小鼠純合與否，選擇純合的雄性并伴有明顯糖尿病癥狀的MKR小鼠作為實驗用鼠。

1.3 DC的制備 稱取200 g鐵皮石斛，粉碎至1～2 cm的小段，加入1 L水浸泡1 h。煎煮2次，合并2次水煎液，用紗布過濾，濃縮至50 mL，最終取得的DC濃度按照生藥量計算為4 g·mL-1。

1.4 小鼠葡萄糖耐量實驗(glucose tolerance test，GTT)和胰島素耐量實驗(insulin tolerance test，ITT) GTT：小鼠禁食12～14 h后，腹腔注射20 %葡萄糖溶液，注射體積為小鼠體質(zhì)量(g)×10 μL，檢測0、15 、30、60和120 min時小鼠血糖水平。ITT：小鼠禁食4～6 h后，腹腔注射0.1 U·mL-1胰島素溶液，注射體積為小鼠體質(zhì)量(g)×10 μL，檢測0、15、30 和60 min時小鼠血糖水平。

1.5 DC降糖作用最佳濃度篩選實驗及各組小鼠血糖水平檢測 9周齡MKR小鼠隨機分為空白對照組和10 、20 及40 g·kg-1·d-1DC組，每組3只，分別灌胃給予生理鹽水和相應劑量DC，連續(xù)灌胃4周。通過GTT和ITT篩選DC降糖作用最佳濃度。另選取8周齡的MKR雄性小鼠隨機分為對照組、DC組、二甲雙胍(Met)組和聯(lián)合用藥(Met+DC)組，每組3只，連續(xù)給藥8周，通過GTT和ITT檢測各組小鼠血糖水平。其中，DC濃度為上述實驗篩選出的DC降糖作用最佳濃度，Met濃度為300 mg·kg-1·d-1。實驗結束后，處死各組小鼠，留取肝臟和皮下脂肪組織，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 qPCR法檢測小鼠肝臟組織中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)、葡萄糖激酶(Gck)和皮下脂肪組織中氧化物酶增殖物激活受體γ( Ppar-γ )mRNA表達水平 利用Trizol 法提取各組小鼠肝臟和皮下脂肪組織RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列：GAPDH，上游引物GGAGAAACCTGCCAAGTATG, 下游引物GGAGTTGCTGTTGAAGTCGC；Pepck，上游引物GAGAGCCTGCCTCCACAA，下游引物CGACCCAGCTGGCTACTT； Gck，上游引物AGGAGGCCAGTGTAAAGATGT，下游引物 CTCCCAGGTCTAAGGAGAGAAA； Ppar-γ，上游引物TGTGGACCTCTCCGTGATGG，下游引物GGTTCTACTGCACTTTGG。采用7900H T Fast Real-Time PCR System進行 qPCR檢測和分析。以GAPDH為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計算各基因的mRNA表達水平。

1.7 細胞培養(yǎng) 小鼠胰島瘤MIN6細胞常規(guī)培養(yǎng)于含13% 胎牛血清、三抗(100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素及100 U·mL-1兩性霉素B)的DMEM培養(yǎng)液中，置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.8 MTT法檢測細胞增殖活性[5]取對數(shù)生長期細胞，消化制備單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為3 000個/孔，接種于96孔板，不同藥物處理48 h后，每孔加入MTT(5 g·L-1)10 μL，37℃孵育4 h，吸去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO溶液150 μL，振蕩10 min，用酶標儀于490 nm波長處檢測吸光度(A)值，以A值代表細胞增殖活性，實驗重復3次。

1.9 葡萄糖刺激下的胰島素分泌能力實驗(GSIS) 為進一步探索DC對胰島細胞增殖和胰島素分泌的影響，采用高濃度棕櫚酸(H-PA)和高濃度葡萄糖(H-Glu)誘導MIN6細胞胰島素抵抗，MIN6細胞分別置于不同濃度H-PA( 5、10、20 、40、80、160和320 μmol·L-1)、H-Glu(5、30 和60 mmol·L-1)和DC(0、0.48、0.96、1.44、1.92、2.40、2.88、3.37和3.80 g·L-1)中培養(yǎng)48 h，最終選定H-PA和H-Glu 最佳誘導濃度和DC作用濃度。

MIN6細胞分為對照組、H-PA組、H-Glu組、H-PA+H-Glu組 、H-PA+DC組、H-Glu+DC組和H-PA+H-Glu+DC組。將各組MIN6細胞置于不同條件處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)基，改用無糖KRBB液中培養(yǎng)2 h，棄去培養(yǎng)基，在含2.8和16.7 mmol·L-1葡萄糖的KRBB液中分別培養(yǎng)1 h，收集上清，ELISA試劑盒檢測各組細胞中胰島素水平。

1.10 Annexin Ⅴ/PI 雙染試劑盒檢測MIN6細胞凋亡率 選取對數(shù)生長期MIN6細胞，分組方法同1.9，分別采用不同藥物處理后，用Annexin Ⅴ/PI Kit溶液與細胞混懸液按比例混勻后室溫放置20 min，按照試劑盒說明采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡率[6]。

1.11 Western blotting法檢測MIN6細胞中PI3K/AKT通路蛋白表達水平 選取對數(shù)生長期MIN6細胞，分組方法同1.9，收集各組細胞，加入裂解液提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本，再將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入p-IRS-1、p-PI3K、p-AKT和p-GSK3β一抗、二抗孵育，ECL顯影。以各實驗組與對照組灰度值之比表示蛋白表達水平[7]。

2 結 果

2.1 DC降糖作用最佳濃度篩選實驗 與空白對照組比較，20 和40 g·kg-1·d-1DC組小鼠血糖水平明顯降低(P<0.05)(圖1A)。給藥后ITT結果顯示：與空白對照組比較，注射胰島素后30和60 min時，20 g·kg-1·d-1DC組小鼠血糖水平明顯降低(P<0.05)，即20 g·kg-1·d-1DC對小鼠胰島素抵抗有一定的改善作用(圖1B)。小鼠給藥后2 h內(nèi)血糖水平檢測結果顯示：與空白對照組比較，20和40 g·kg-1·d-1DC組小鼠血糖水平降低(P<0.05)(圖1C)。最終選擇生藥量20 g·kg-1·d-1作為與Met聯(lián)合用藥的DC最佳濃度。

2.2 各組MKR小鼠血糖水平及GTT和ITT結果 給藥后各組小鼠隨機血糖：與對照組比較，DC組(P>0.05)和Met組(P<0.05)小鼠隨機血糖水平有所降低，聯(lián)合用藥組小鼠血糖水平降低更加明顯(P<0.05)；與Met組比較，聯(lián)合用藥組小鼠隨機血糖水平明顯降低(P<0.05)。給藥8周后，GTT結果顯示：與對照組比較，其余各組小鼠在注射葡萄糖60 min后血糖水平降低，聯(lián)合用藥組小鼠血糖水平降低更加明顯；ITT結果顯示：聯(lián)合用藥組小鼠胰島素敏感性明顯提高，胰島素抵抗情況明顯改善。見圖 2。

2.3 各組MKR小鼠肝臟組織中Pepck、Gck和皮下脂肪組織中 Ppar-γ mRNA表達水平 與對照組比較，聯(lián)合用藥組小鼠肝臟組織中Pepck mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，Gck mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與對照組比較，Met組和聯(lián)合用藥組小鼠皮下脂肪組織中Ppar-γ mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。見表1。

*P<0.05 compared with blank control group;1:Blank control group;2:10 g·kg-1·d-1DC group;3:20 g·kg-1·d-1DC group;4:40 g·kg-1·d-1DC group.A: The fasted blood glucose levels of MKR mice after treated by DC for 8 weeks； B: The insulin tolerance test of MKR mice after treated by DC for 8 weeks； C: The blood glucose levels of MKR mice after treated by DC for 120 min.

圖1 DC降糖最佳濃度篩選

Fig.1 Determination of optimum concentration of DC in reducing blood glucose levels

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with Met group.A: The blood glucose levels of MKR mice treated by DC and (or) metformin； B:The glucose tolerance test of MKR mice treated by DC and (or) metformin； C: The insulin tolerance test of MKR mice treated by DC and (or) metformin.

圖2 各組MKR小鼠血糖水平和GTT及ITT結果

Fig.2 Levels of blood glucose and results of GTT and ITT of MKR mice in various groups

表1 各組MKR小鼠肝臟組織中Pepck、Gck和皮下脂肪組織中 Ppar-γ mRNA表達水平

GroupPepckGckPpar-γControl1.000±0.3661.000±0.1241.000±0.104DC0.700±0.0841.000±0.0401.500±0.653Met0.600±0.1071.100±0.0591.400±0.075?Met+DC0.600±0.043?1.300±0.080?1.800±0.408?

*P<0.05 compared with control group.

2.4 各組MIN6細胞增殖活性和GSIS實驗中各組MIN6細胞胰島素分泌水平 采用H-PA和H-Glu對MIN6細胞誘導胰島素抵抗，結果顯示：MTT法檢測H-PA誘導下各組細胞增殖活性，與對照組比較，80、160和320 μmol·L-1H-PA組MIN6細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)，H-PA 最適誘導濃度為160 μmol·L-1(表2)；ELISA法檢測H-Glu誘導下各組細胞胰島素分泌水平，與對照組比較，30 和60 mmol·L-1H-Glu組MIN6細胞胰島素分泌水平明顯降低(P<0.05)，最終確定H-Glu最適誘導濃度為30 mmol·L-1(表3)；MTT法檢測DC作用下各組細胞增殖活性，與對照組比較，0.96、1.44、1.92、2.40、2.88、3.37和3.80 g·L-1DC組MIN6細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)， DC最適作用濃度為1.44 g·L-1(表4)。MIN6細胞在2.8 和16.7 mmol·L-1葡萄糖刺激下GSIS實驗結果顯示：分別與H-PA組、H-Glu組和H-PA+H-Glu組比較，加入DC后，H-PA+DC組、H-Glu+DC 組和H-PA+H-Glu+DC 組MIN6細胞胰島素分泌水平明顯升高(P<0.05)，表明DC可改善H-PA或(和)H-Glu誘導的胰島素抵抗(圖3)。

2.5 流式細胞術檢測各組MIN6細胞凋亡率 與對照組(0%)比較， H-PA組、H-Glu組和H-PA+H-Glu組MIN6細胞凋亡率明顯升高。經(jīng)DC處理后，H-PA+DC組、H-Glu+DC組和 H-PA+H-Glu+DC組細胞凋亡率分別降低了9.99%、21.51%和25.02%(圖 4和表5)。

表2 MTT法檢測H-PA 誘導下各組MIN6細胞增殖活性

GroupA valueControl 0.526±0.050H-PA(μmol·L-1) 5 0.504±0.052 10 0.476±0.023 20 0.433±0.056 40 0.421±0.017 80 0.334±0.020? 160 0.268±0.021? 320 0.257±0.045?

*P<0.05 compared with control group.

表3 ELISA 法檢測H-Glu誘導下各組MIN6細胞胰島素分泌水平

GroupInsulin[ρB/(ng·L-1)]Glucose(mmol·L-1)2.8 16.7Control490.6±31.01 347.4±58.9H-Glu(mmol·L-1) 5478.0±21.21 235.8±39.7 3096.2±25.8?670.7±21.1? 6021.9±18.1?470.4±21.0?

*P<0.05 compared with control group.

2.6 各組MIN6細胞中PI3K/AKT通路蛋白表達水平 與對照組比較，H-Glu組、H-PA組和H-PA +H-Glu組MIN6細胞中p-IRS-1、p-PI3K和p-AKT表達水平明顯降低(P<0.05)，H-PA+H-Glu 組MIN6細胞中p-GSK3β表達水平明顯升高(P<0.05)；分別與H-Glu組、H-PA組和H-PA+H-Glu組比較，加入DC后，H-Glu+DC組、H-PA+DC 組和H-PA+H-Glu+DC 組MIN6細胞中p-IRS-1、p-PI3K和p-AKT表達水平明顯升高(P<0.05)， H-PA+H-Glu+DC組MIN6細胞中 p-GSK3β表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖5和表6、7。

表4 MTT法檢測DC作用下各組MIN6細胞增殖活性

GroupA valueControl 0.677±0.018DC(g·L-1) 0.48 0.615±0.014 0.960.561±0.018? 1.44 0.514±0.022? 1.92 0.403±0.021? 2.400.342±0.020? 2.880.264±0.071? 3.370.102±0.015? 3.800.072±0.002?

*P<0.05 compared with control group.

*P<0.05 compared with H-Glu(30 mmol·L-1) group;△P<0.05 compared with H-PA (160 μmol·L-1) group;#P<0.05 compared with H-PA (160 μmol·L-1)+H-Glu(30 mmol·L-1) group.

圖3 ELISA法檢測各組MIN6細胞胰島素分泌水平

Fig.3 Levels of insulin secretion of MIN6 cells in various groups detected by ELISA

3 討 論

2型糖尿病的發(fā)病原因主要為外周組織(肝臟、脂肪和肌肉)胰島素抵抗和胰島細胞分泌胰島素受損。單純西藥治療2型糖尿病的不良反應越來越受到關注。中醫(yī)以整體觀念為核心思想，在糖尿病的治療方面，既能改善糖尿病的表現(xiàn)癥狀，降低血糖，又能保護外周組織，預防并發(fā)癥的發(fā)生。施紅等[4, 8]以石斛為君藥組方配制了石斛合劑，通過臨床觀察和實驗研究發(fā)現(xiàn)：石斛合劑對高血糖有明顯的治療作用。黎同明等[9]發(fā)現(xiàn)：石斛合劑對STZ誘導的2型糖尿病大鼠有明顯的降糖作用，并且可以保護和修復受損的胰腺組織。石斛可以通過影響肝臟的糖代謝和胰島細胞的分泌功能來改善糖尿病癥狀。

A:Control group；B:H-Glu group；C：H-Glu+DC group； D：H-PA group； E：H-PA+DC group； F：H-PA+H-Glu group； G：H-PA+H-Glu+DC group.

圖4 流式細胞術檢測各組MIN6細胞凋亡率

Fig.4 Apoptotic rates of MIN6 cells in various groups detected by flow cytometry

表5 各組MIN6細胞凋亡率

GroupEarly apoptotic rateLate apoptotic rateControl00H-Glu31.246.92H-Glu+DC25.732.44H-PA48.1214.80H-PA+DC32.788.63H-PA+H-Glu62.305.38H-PA+H-Glu+DC37.115.63

Lane 1,6:Control group;Lane 2:H-Glu group;Lane 3:H-Glu+DC group;Lane 4:H-PA group;Lane 5:H-PA+DC group;Lane 7:H-PA+H -Glu+DC group;Lane 8:H-PA+H-Glu+DC group.

圖5 Western blotting 法檢測各組MIN6細胞中PI3K/AKT通路蛋白表達電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expressions of PI3K/AKT pathway proteins in MIN6 cells detected by Western blotting method

表6 各組MIN6細胞中p-IRS-1、p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平

Groupp-IRS1p-PI3Kp-AKTControl1.000±0.0071.000±0.0061.000±0.019H-Glu0.780±0.075?0.520±0.041?0.320±0.017?H-Glu+DC0.990±0.032△0.700±0.038△0.530±0.240△H-PA0.880±0.021?0.120±0.028?0.230±0.039?H-PA+DC0.980±0.082#0.580±0.021#0.450±0.003#

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with H-Glu group；#P<0.05 compared with H-PA group.

本研究首次使用瘦型MKR糖尿病小鼠模型對DC的降糖作用進行研究，并在體外利用MIN6胰島瘤細胞研究DC對胰島細胞分泌功能的影響。MKR小鼠是通過轉(zhuǎn)基因技術在小鼠骨骼肌中特異性高表達人源性IGF-1受體顯性抑制突變體。與同周齡野生型小鼠比較，MKR小鼠體質(zhì)量較輕，隨著小鼠生長，逐漸出現(xiàn)高血糖、高血脂和高胰島素血癥，是研究非肥胖2型糖尿病的最佳模型[10-11]。MIN6細胞系是從表達類人猿病毒40大T抗原(受胰島毒啟動子控制)的轉(zhuǎn)基因非肥胖糖尿病小鼠胰島瘤中建立的，其內(nèi)分泌功能與胰腺組織非常接近，是研究胰島細胞功能的理想模型[12]。

表7 各組MIN6細胞中p-IRS-1、p-PI3K、p-AKT和p-GSK3β蛋白表達水平

Groupp-IRS1p-PI3Kp-AKTp-GSK3βControl1.000±0.0371.000±0.0181.000±0.0261.000±0.031H-PA+H-Glu 0.110±0.021?0.870±0.034?0.210±0.039?1.210±0.017?H-PA+H-Glu+DC 0.310±0.043△1.220±0.036△0.710±0.021△1.110±0.025△

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with H-PA+H-Glu group.

MKR小鼠體內(nèi)的糖代謝異常和胰島素抵抗情況與多種因素有關，其中肝臟糖異生和糖降解在血糖調(diào)節(jié)中起關鍵作用。Pepck是糖異生中最重要的酶之一，其表達水平直接反映糖異生的效率[13-14]；Gck是糖代謝中第一個限速酶，其水平直接影響體內(nèi)糖代謝過程[15- 16]。本研究結果顯示：聯(lián)合用藥組小鼠肝臟組織中Pepck mRNA表達水平明顯降低，Gck表達水平明顯升高?？梢姡珼C聯(lián)合Met主要通過調(diào)節(jié)Pepck和Gck的表達來改善受損肝臟的糖代謝過程。

Ppar-γ是過氧化物酶增殖物激活受體家族中的一員，在糖脂代謝和胰島素信號通路中發(fā)揮重要作用。Ppar-γ在脂肪組織中的表達水平最高，并通過提高外周組織對胰島素的敏感性來調(diào)節(jié)糖脂代謝[17-19]。本研究結果顯示：DC聯(lián)合Met用藥8周后，小鼠皮下脂肪組織中Ppar-γ mRNA表達水平明顯升高，表明DC聯(lián)合Met可能通過上調(diào)Ppar-γ的表達來提高胰島素敏感性，從而緩減胰島素抵抗癥狀。

為了進一步探索DC對β細胞的影響，本實驗利用高脂、高糖環(huán)境所誘導的MIN6細胞胰島素抵抗來研究DC對β細胞胰島素分泌的影響。本研究結果顯示：DC可以改善棕櫚酸和葡萄糖所誘導的MIN6細胞胰島素抵抗，降低MIN6細胞凋亡率，并可激活棕櫚酸和葡萄糖損害的胰島素信號通路(PI3K/AKT )[20-21]，從而改善胰島素抵抗。

綜上所述，本研究從動物水平和細胞水平對DC治療糖尿病的機制進行探討，結果表明：DC對糖尿病的治療是多靶點的，一方面DC可以通過調(diào)節(jié)糖代謝降低小鼠血糖，另一方面可以通過提高胰島素敏感性來改善小鼠的胰島素抵抗；與Met組比較，Met+DC組小鼠降糖效果明顯提高，糖耐量和胰島素敏感性明顯改善，可能是DC擴充了Met單靶點的作用機制; 細胞實驗結果也表明：DC可以增加胰腺β細胞分泌胰島素的能力，并可激活胰島素信號通路。本研究采用體內(nèi)和體外實驗探討了DC對糖尿病的治療作用及其作用機制，豐富了中西醫(yī)結合治療糖尿病的理論，為尋找治療糖尿病的新藥物和新方法提供了理論依據(jù)。