安 樂(lè)，楊建征，胡春梅，于 瓊，肖 晗，郝書(shū)弘，唐 艷

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤血液科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是一種常見(jiàn)的單基因遺傳病[1-2]。ADPKD主要由PKDl和PKD2基因突變引起,PKD1和PKD2分別編碼多囊蛋白1 (polycystin-1，PC1)和多囊蛋白2 (polycystin-1，PC2)。目前研究[3-6]顯示：85%～90%的ADPKD與PKD1基因突變有關(guān)。

在ADPKD的發(fā)病過(guò)程中，凋亡信號(hào)通路被激活[7-8]，細(xì)胞凋亡的增加可引起囊泡的發(fā)生[9]，國(guó)內(nèi)外許多研究把干預(yù)囊腫上皮細(xì)胞凋亡作為重點(diǎn)，從而達(dá)到抑制多囊腎囊腫形成的治療目的。PC1是一個(gè)具有長(zhǎng)的細(xì)胞外氨基末端、 11個(gè)跨膜區(qū)和短的細(xì)胞內(nèi)羧基末端的跨膜蛋白[10-11]。PC1在MDCK腎細(xì)胞中的表達(dá)可引起微管的構(gòu)建并抑制細(xì)胞凋亡[12]；PC1抗凋亡的機(jī)制目前尚不清楚，參與PC1抑制凋亡的信號(hào)途徑目前已較明確的是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)等[13-15]。PC1調(diào)節(jié)蛋白激酶R(PKR)/真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(eIF2α)信號(hào)通路及對(duì)凋亡影響的研究[15]顯示：PC1重組蛋白pEGPF-PC1-5TMC對(duì)HEK293T細(xì)胞凋亡具有抑制作用。PC1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞是否具有抗凋亡作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取宮頸癌HeLa細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用MTT法和TUNE法檢測(cè)PC1對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)一步明確PC1的抗凋亡作用,為研究PC1在惡性腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和試劑 人宮頸癌HeLa細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。在含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 ～3 d更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁率達(dá)到70% ～80%進(jìn)行細(xì)胞傳代?？瞻讓?duì)照質(zhì)粒pEGFP和PC1基因重組質(zhì)粒pEGFP-PC1-5TMC[15]由陳興珍博士惠贈(zèng)。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，MTT和DMSO 購(gòu)自華美公司，DMEM完全培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，綠色熒光蛋白(GFP)單抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自鼎國(guó)生物公司，化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，TUNEL測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，硝酸纖維膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 轉(zhuǎn) 染 HeLa細(xì)胞以2.0×104/孔密度接種6孔板,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后更換新鮮培養(yǎng)液,采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液分別稀釋質(zhì)粒pEGFP、pEGFP-PC1-5TMC和LipofectamineTM2000,室溫靜置5 min。將2種稀釋液輕輕混合,室溫放置20 min。將混合液加至對(duì)應(yīng)的孔板中,置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。6 h 后更換成新鮮含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒pEGFP組為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染PC1基因重組質(zhì)粒pEGFP-PC1-5TMC組為轉(zhuǎn)染組。

1.3 Western blotting法鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞 轉(zhuǎn)染后24 h，提取細(xì)胞的蛋白,蛋白濃度按Bradford法選擇BSA作為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白濃度。80 μg蛋白用10%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，抗體按照GFP單抗1∶2 000、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 1∶500使用。按照化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行雜交。

1.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分為3組。轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染pEGFP-PC1-5TMC質(zhì)粒組; 空白對(duì)照組:轉(zhuǎn)染pEGFP空白對(duì)照質(zhì)粒組; 正常對(duì)照組：未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h，將細(xì)胞小心收集并接種到96 孔培養(yǎng)板中,每小孔加入200 μL(相當(dāng)于1×104個(gè)細(xì)胞) 細(xì)胞懸液。每板設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照和正常對(duì)照，每組設(shè)定6復(fù)孔。分別在24和48 h(轉(zhuǎn)染后48和72 h)采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞吸光度(A)值。將5 g ·L-1MTT 用Dilution Buffer稀釋成 1 g·L-1，每小孔加入50 μL MTT，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h;吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，在平板搖床上搖勻。在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔A值,細(xì)胞增殖活性=測(cè)量孔A值-培養(yǎng)基對(duì)照孔A值。

1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pEGFP-PC1-5TMC質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染組)和pEGFP質(zhì)粒(空白對(duì)照組)，轉(zhuǎn)染后48 h，將細(xì)胞晾干并經(jīng)2%多聚甲醛室溫固定10 min,PBS洗滌2次，室溫置于穿透液(含0.05%Triton X-100 的PBS)中3 min,然后按照TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作，倒置顯微鏡觀察。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù):每實(shí)驗(yàn)組切片數(shù)28個(gè)，每個(gè)切片取8個(gè)陽(yáng)性視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 PC1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株的鑒定 Western blotting法鑒定PC1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株，采用GFP單抗檢測(cè)，在相對(duì)分子質(zhì)量約68 000處顯示 pEGFP-PC1-5TMC蛋白條帶。見(jiàn)圖1。

Lane 1: Blank control group; Lane 2: Transfection group.

圖1 Western blotting法鑒定HeLa細(xì)胞中pEGFP-PC1-5TMC表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of pEGFP-PC1-5TMC expressions in HeLa cells identified by Western blotting method

2.2 各組細(xì)胞增殖活性 在轉(zhuǎn)染后48和72 h，與正常對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 轉(zhuǎn)染后48和72 h各組HeLa細(xì)胞增殖活性

GroupA value(t/h) 4872Normal control0.762±0.0541.182±0.083Blank control0.629±0.0371.053±0.031Transfection0.727±0.076?1.154±0.079?

*P<0.05 compared with blank control group.

2.3 各組細(xì)胞凋亡率 TUNEL法結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后48 h，轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組均有TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞多數(shù)皺縮變圓，顆粒感增強(qiáng)，但轉(zhuǎn)染組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于空白對(duì)照組(圖2)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率(4.2%±1.6%)明顯低于空白對(duì)照組(7.6%±1.7%)(P<0.01)。

A：Blank control group；B：Transfection group.

Fig.2 Apoptosis of HeLa cells in various groups detected by TUNEL assay(×200)

3 討 論

既往有關(guān)PC1抗凋亡作用的研究較少，但已在犬腎上皮MDCK細(xì)胞、 人肝癌HepG2細(xì)胞及人胚腎HEK293T細(xì)胞中證實(shí)PC1具有抗凋亡作用[13-15]。

MTT法可以靈敏地檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)，在生物實(shí)驗(yàn)中通常用來(lái)測(cè)定細(xì)胞增殖活性。本研究通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48和72 h時(shí)細(xì)胞增殖情況，了解PC1對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果顯示：PC1基因過(guò)表達(dá)有助于維持細(xì)胞增殖，提示PC1對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡具有抑制作用。TUNEL法是目前用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常用方法之一，其優(yōu)點(diǎn)是靈敏、可靠，目前有關(guān)PC1對(duì)細(xì)胞抑制凋亡作用的研究多采用TUNEL法[13,15]。本研究結(jié)果顯示: PC1明顯抑制細(xì)胞凋亡率，表明PC1對(duì)HeLa細(xì)胞具有抗凋亡作用。

PC1和PC2除了在細(xì)胞感應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用外，還參與多種惡性腫瘤的發(fā)病[16-19]，具有較廣闊的研究前景。本研究結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)了PC1具有抗凋亡作用，還為PC1在腫瘤細(xì)胞中的抗凋亡機(jī)制研究提供了依據(jù)。本研究結(jié)果符合既往研究已證實(shí)的PC1對(duì)MDCK、 HepG2和HEK293T細(xì)胞有抑制凋亡作用的結(jié)論，尤其與PC1對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抗凋亡作用一致，但也有關(guān)于PC1能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞HepG2、A549和SW480凋亡的報(bào)道[20],因此，PC1在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制尚有待更多的研究進(jìn)一步明確。