* * 1,,3

1.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大理大學(xué)，云南 大理 671000；2.上海華匯拓醫(yī)藥科技有限公司，上海市 浦東新區(qū) 201203；3.藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/大理大學(xué)，云南 大理 671000

腦血管疾病是全身性血管病變或系統(tǒng)性血管病在腦部的表現(xiàn)，是血管源性腦部病損的總稱，中醫(yī)稱“中風(fēng)”，具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響人們的健康以及社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[1]。目前臨床上常用的預(yù)防和治療缺血性腦血管疾病的藥物有溶栓、抗凝和抗血小板聚集藥[2]，其中抗血小板治療是缺血性腦卒中二級(jí)預(yù)防的重要手段[3]。因此，低毒副作用、可長(zhǎng)期使用的抗血小板聚集藥物的開(kāi)發(fā)是當(dāng)前防治腦血管疾病藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。

動(dòng)物毒素，如水蛭[4]、蚯蚓[5]、蛛毒[6]、蛇毒[7]，及昆蟲(chóng)毒素[8-9]等具有明顯的抗血栓作用。蜜蜂蜂毒由蜜蜂的毒腺分泌并貯存于毒囊中，是一種成分復(fù)雜且藥理作用較多的無(wú)色芳香液體[10]，研究發(fā)現(xiàn)，其具有很強(qiáng)的抗凝血[11]及抗血栓[12]作用，能使血液凝固時(shí)間明顯延長(zhǎng)。但是是否通過(guò)皮下注射蜜蜂蜂毒，研究蜜蜂蜂毒抗血小板聚集作用則未見(jiàn)相關(guān)報(bào)導(dǎo)。基于此，本課題以ADP二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate, ADP)、膠原(Collagen, COL)為誘導(dǎo)劑，研究蜜蜂蜂毒(BV)對(duì)家兔血小板聚集和粘附功能的影響，進(jìn)一步探討B(tài)V作為防治心腦血管病抗栓的可能性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性家兔，體重2.0～2.5 kg，購(gòu)于大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5周后用于正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)條件：清潔級(jí)，室溫16～22 ℃，相對(duì)濕度68%，12 h明暗交替照明，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 藥物和試劑 蜜蜂蜂毒(BV，批號(hào)：20160927，藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心)；枸櫞酸鈉(批號(hào)：1204261，四川西隴化工有限公司)；氯化鈉注射液(批號(hào)：C150120L，昆明南疆制藥有限公司)；二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP，批號(hào)：7-16-5366，Helena工廠)；膠原(Collagen，COL，批號(hào)：5-16-5368，Helena工廠)；氯吡咯雷(批號(hào)：20140929，深圳市麗晶生化科技有限公司)。

1.3 儀器 AggRAM血小板聚集儀(Helena Laboratories)；BSA124S微量電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；TCL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)；DHG-9240電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；VORTEX-5漩渦混合器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；SK8200H超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)的制備 參考文獻(xiàn)的方法[13]，將血液加入含有3.2%枸櫞酸鈉的離心管中，使3.2%枸櫞酸鈉和血液的容積之比為1∶9。將上述得到的抗凝血充分混勻后25 ℃下以100 g的離心力離心10 min后取上層血漿即為PRP。然后將剩余的血漿，25℃下以2000 g的離心力離心15 min后取上層血漿即為PPP。

2.2 血小板聚集實(shí)驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取健康雄性家兔30只，根據(jù)體重均分為5組，分別為生理鹽水組(NS組)、氯吡格雷組(3.85 mg/kg·BW)、和BV 0.18、0.36、0.72 mg/kg·BW劑量組。其中，NS組為溶媒對(duì)照組、氯吡格雷組為陽(yáng)性對(duì)照組[14]，氯吡格雷采用灌胃給藥,灌胃體積是2.5 mL/kg,BV組采用皮下注射,體積為2 mL。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 各實(shí)驗(yàn)組連續(xù)給藥5 d，每天上午給藥1次，末次給藥后1.5 h進(jìn)行心臟取血，之后按照“2.1”的實(shí)驗(yàn)方法制備PRP和PPP。采用比濁法測(cè)定血小板聚集率：取PPP 250 μL于比濁杯中，以含PPP杯為基準(zhǔn)調(diào)零，在PRP杯中分別加入25 μL的ADP、COL，誘導(dǎo)血小板聚集，測(cè)定5 min內(nèi)血小板最大聚集率。其中，誘導(dǎo)劑ADP、COL的終濃度分別為6.07 μmol/L、3.03 μg/mL。抑制率的計(jì)算公式如下：

2.3 血小板粘附實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物分組、各組劑量和給藥方法同“2.2.1”。各實(shí)驗(yàn)組 連續(xù)給藥5 d，于末次給藥后1.5 h時(shí)立即對(duì)家兔進(jìn)行心臟取血，制備PRP和PPP，參考實(shí)驗(yàn)方法[15]加入35 μL的COL，在血小板聚集儀上進(jìn)行溫育攪拌10 min，分別測(cè)定加入COL前后血小板的光密度(Optical density，OD)值。血小板粘附率的計(jì)算公式如下：

其中常數(shù)1.11系加膠原后PRP被稀釋的校正值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用One-Way ANOVA(即單因素方差分析)，事后檢驗(yàn)采用LSD(最小顯著性差異)法，方差不齊采用Tamhamne’s T2法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血小板聚集實(shí)驗(yàn) BV低、中、高劑量連續(xù)注射5 d，開(kāi)始家兔出現(xiàn)輕微呼吸加促的現(xiàn)象，第5天，家兔身體狀況無(wú)明顯變化，對(duì)家兔健康無(wú)不良影響。由表1可知，ADP誘導(dǎo)時(shí)，NS組的聚集率為(64.93±4.97)%。與NS組比較，氯吡格雷組、BV低、中、高劑量組均可以顯著降低ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率：59.31%(P<0.05)、26.54%(P<0.05)、36.62%(P<0.05)、51.11%(P<0.05)，受試藥物各組呈量效依賴關(guān)系。由表2可知，COL誘導(dǎo)時(shí)，NS組聚集率(77.40±7.91)%。與NS組比較，氯吡格雷組和BV中、高劑量組的血小板聚集率都明顯降低(P<0.05)其中BV高劑量組抑制率達(dá)62.90%，基本和陽(yáng)性藥相當(dāng)。

組別劑量/mg/kg聚集率/%抑制率/%NS組- 64.93±4.97-氯吡格雷組3.8526.42±5.42**59.310.1847.70±3.18*26.54BV0.3643.10±13.21**36.620.7229.80±14.30**51.11

注：與NS 組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別劑量/mg/kg聚集率/%抑制率/%NS組-77.40±7.91 -氯吡格雷組3.8520.48±18.13**73.930.1862.60±13.0019.12BV0.3647.62±14.65**29.280.7228.72±13.34**62.90

注：與NS組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 血小板粘附實(shí)驗(yàn) 由表3可知，與NS組比較，氯吡格雷組、BV中、高劑量組均能降低COL誘導(dǎo)的血小板粘附性(P<0.05)，粘附抑制率分別為47.36%、43.94%、49.36%，BV中、高劑量組效果基本和陽(yáng)性藥相當(dāng)。

組別劑量/mg/kg粘附率/%粘附抑制率/%NS組-79.25±7.53-氯吡格雷組3.8541.72±25.74*47.360.1868.95±4.7612.99BV0.3644.43±21.76*43.940.7240.13±28.01*49.36

注：與NS組比較，*P<0.05。

4 討論

血小板的活化和聚集是血栓形成的重要病理基礎(chǔ)?？寡“逅幬锸峭ㄟ^(guò)抑制血小板的異常形變、粘附、聚集和釋放反應(yīng)以抑制血栓形成和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展。因此抗血小板藥物是防治心、腦血管疾病的重要藥物。

血小板膜上有ADP、膠原、凝血酶等多種受體，任何一種受體被其誘導(dǎo)劑激活后，血小板表面即表達(dá)出纖維蛋白原受體(GPIIb-IIIa)，纖維蛋白原受體與纖維蛋白原結(jié)合，導(dǎo)致血小板聚集。不同的誘導(dǎo)劑使血小板活化聚集的能力也不同，如誘導(dǎo)能力強(qiáng)的凝血酶和COL可引發(fā)血小板內(nèi)各種顆粒內(nèi)容物的聚集；而誘導(dǎo)能力中等的花生四烯酸和血小板活化因子使血小板活化變形的能力不如上述的強(qiáng)誘導(dǎo)劑；誘導(dǎo)能力弱的5-HT和ADP則需要血小板分泌顆粒內(nèi)容物協(xié)助其作用，方可引發(fā)血小板不可逆的聚集反應(yīng)；誘導(dǎo)劑腎上腺素則只有在超過(guò)生理濃度下才能發(fā)揮作用[16]。ADP是引發(fā)血小板聚集的活性物質(zhì)，雖然它本身是弱誘導(dǎo)劑，但其能增強(qiáng)或放大其它誘導(dǎo)劑的作用，比如一些弱的誘導(dǎo)劑如腎上腺素或5-HT等化學(xué)激活劑。氯吡格雷為ADP受體阻斷劑，臨床一線抗栓藥物，本實(shí)驗(yàn)選其為陽(yáng)性藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蜜蜂蜂毒對(duì)ADP、COL誘導(dǎo)的家兔血小板聚集有較好的抑制作用。文獻(xiàn)中[17]也有報(bào)道小劑量蜂毒可抑制ADP所引起的血小板聚集，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

血小板粘附機(jī)制中有三種主要成分起作用：血小板膜糖蛋白、內(nèi)皮下組份和vWF。血管內(nèi)皮下基質(zhì)的主要成分是纖維狀I(lǐng)、III、VI型膠原、纖維連接蛋白和vWF等。當(dāng)中最重要的是膠原，它既是經(jīng)常發(fā)生血小板粘附的部位，激發(fā)血小板變形活化的能力也強(qiáng)。血小板的表面有兩類主要的膠原受體：血小板GPVI和整合素α2β1(GPIa/IIa)，這兩種受體可以直接粘附于膠原。但是GPIb/XI/V復(fù)合物粘附于膠原的過(guò)需要vWF介導(dǎo)[18]。參與血小板粘附過(guò)程的血小板膜糖蛋白主要有GPIIb-IIIa和GPIb-IX，二者分別在血小板粘附過(guò)程的不同階段發(fā)揮作用，但都是vWF的受體。當(dāng)GPIb-IX經(jīng)vWF的橋連介導(dǎo)作用與膠原發(fā)生接觸粘附時(shí)會(huì)致使血小板變形活化，同時(shí)GPIIb-IIIa的受體部位也會(huì)被暴露出來(lái)。GPIIb-IIIa之所以可以使血小板呈現(xiàn)伸展變形的粘附狀態(tài)，是因?yàn)槠淇梢哉掣接趘WF、纖維蛋白原以及多種的粘附蛋白(如：纖維連接蛋白)。

文獻(xiàn)[19]多采用血小板粘附儀，利用血小板計(jì)數(shù)法計(jì)算粘附率，本研究參考文獻(xiàn)[15]采用血小板聚集儀測(cè)定富血小板血漿OD值的方法計(jì)算粘附率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)膠原和血小板接觸引起的粘附，陽(yáng)性藥氯吡格雷有顯著地抑制作用，這與文獻(xiàn)[20-21]報(bào)道一致。BV中劑量和高劑量組對(duì)血小板粘附也有一定的抑制作用，與陽(yáng)性藥比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)室前期的大鼠動(dòng)靜脈旁路實(shí)驗(yàn)中，BV可以抑制血小板在絲線上的粘附，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，本研究表明蜜蜂蜂毒對(duì)ADP、COL誘導(dǎo)的家兔血小板聚集有一定的抑制作用，其還可以抑制血小板在膠原表面的粘附。本實(shí)驗(yàn)研究為進(jìn)一步的抗腦缺血整體評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，為預(yù)防和治療心腦血管疾病提供一定的科學(xué)依據(jù)。