張雪松裴建軍趙林果湯 鋒房仙穎

(1. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400；2. 南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037；3. 國(guó)際竹藤中心，北京 100714)

桂花是一種重要的經(jīng)濟(jì)觀賞植物，廣泛分布于中國(guó)、日本、泰國(guó)等東南亞國(guó)家，尤其在中國(guó)分布最廣，應(yīng)用最多，品種資源極其豐富，在中國(guó)有2 500多年的栽培歷史[1-2]。桂花的芳香和其生物學(xué)功能使得桂花備受關(guān)注。除了作為功能性食品添加劑外[3]，桂花還有巨大的藥用價(jià)值[4-6]。桂花浸膏的香味優(yōu)雅，可廣泛用于化妝品、香精香料生產(chǎn)中，已遠(yuǎn)銷海外。傳統(tǒng)的桂花浸膏制備工藝所得桂花產(chǎn)品產(chǎn)率及質(zhì)量較低，存在利用不充分等缺點(diǎn)[7]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)桂花產(chǎn)品的研究主要為兩大類：① 采用超臨界CO2技術(shù)提取桂花浸膏、精油的工藝方法[8]；② 桂花精油產(chǎn)品成分的分析檢測(cè)技術(shù)[9-10]。其中，超臨界流體萃取為獲得高品質(zhì)的桂花香料提供了技術(shù)保證[11]。該技術(shù)具有安全、環(huán)保和提取針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但因前期設(shè)備投資大，后期設(shè)備運(yùn)行和維護(hù)成本高，目前還很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[12-13]。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，外源生物酶在植物提取和加工技術(shù)中的使用越來(lái)越廣泛。目前，國(guó)際上香料生產(chǎn)中采用生物技術(shù)成為總體發(fā)展趨勢(shì)。糖苷類香氣前體是香料植物潛在的香氣源[14]，利用酶水解技術(shù)以提高香料產(chǎn)品得率和產(chǎn)品質(zhì)量是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外學(xué)者的主要研究方向[15]。楊志萍等[16]曾利用葡萄糖苷酶處理新鮮桂花，提高了順、反-氧化芳樟醇，L-芳樟醇，萜烯二醇，L-α-萜品醇等香氣成分的含量。

當(dāng)前，桂花香料產(chǎn)品的市場(chǎng)價(jià)格持續(xù)走高，改進(jìn)桂花香料產(chǎn)品的提取加工技術(shù)，提高產(chǎn)品得率和質(zhì)量是桂花行業(yè)深加工過(guò)程中急需解決的問(wèn)題。本試驗(yàn)通過(guò)篩選一些常用風(fēng)味水解酶后，選擇纖維素酶和果膠酶復(fù)配對(duì)桂花進(jìn)行酶處理，基于單因素試驗(yàn)的最優(yōu)條件，利用響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)配酶提取工藝條件，以提高桂花浸膏的得率及主要香氣物質(zhì)含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桂花：金桂，產(chǎn)地為浙江，50 ℃干燥后粉碎，過(guò)40目篩；

檸檬酸氫二鈉、乙醚、石油醚、檸檬酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

正己烷：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

β-葡萄糖苷酶1(110 IU/mL)、β-葡萄糖苷酶3(90 IU/mL)、鼠李糖苷酶(120 IU/mL)：實(shí)驗(yàn)室制備；

脂肪酶(20 000 IU/g)、木聚糖酶(50 000 IU/g)、β-葡聚糖酶(20 000 IU/g)：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；

β-葡萄糖苷酶(100 IU/g)、果膠酶(200 000 IU/g)：南京奧多福尼生物科技有限公司；

GC-MS聯(lián)用儀：Trace DSQ型，美國(guó)Thermo Electro-Finnigan公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-5220型，上海亞榮生化儀器廠；

真空干燥箱：DZF-6021型，上海精密儀器儀表公司；

粉碎機(jī)：FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子數(shù)顯不銹鋼恒溫水浴鍋：HHS112-B型，上海宜昌儀器廠；

酸度計(jì)：HS-25型，上海雷磁儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶處理 稱取15 g粉碎后的桂花，以50 IU/g干桂花，分別選用果膠酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、鼠李糖苷酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酶1以及β-葡萄糖苷酶3在其最適宜條件下，按液料比15∶1 (mL/g)酶解2 h。減壓過(guò)濾后，將酶處理后的桂花在40 ℃下真空干燥2 h。

1.2.2 桂花浸膏制備

(1) 樣品A：15 g粉碎后的桂花經(jīng)過(guò)酶液處理所得桂花樣品。

(2) 樣品B：15 g粉碎后的桂花不加酶處理所得空白對(duì)照樣品。

(3) 樣品C：15 g粉碎后的干桂花樣品。

(4) 桂花浸膏制備：分別將A、B、C 3種樣品，按液料比15∶1 (mL/g)，用石油醚40 ℃回流提取1 h。將提取液過(guò)濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去除石油醚，經(jīng)40 ℃真空干燥獲得桂花浸膏。桂花浸膏經(jīng)正己烷溶解后，采用GC-MS對(duì)其成分進(jìn)行檢測(cè)。按式(1)計(jì)算浸膏得率。

(1)

式中：

c——浸膏得率，%；

m1——干燥后浸膏質(zhì)量，g；

m2——原料質(zhì)量，g。

1.3 GC-MS檢測(cè)

檢測(cè)條件參照文獻(xiàn)[17]。

1.4 單因素試驗(yàn)

(1) pH對(duì)桂花浸膏得率的影響：設(shè)定50 IU/g·原料加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復(fù)配酶處理桂花，復(fù)合酶中β-葡萄糖苷酶與果膠酶酶活之比為1∶1、溫度45 ℃、液料比15∶1 (mL/g)，分別控制pH為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5處理桂花2 h，考察pH對(duì)桂花浸膏得率的影響。

(2) 溫度對(duì)桂花浸膏得率的影響：設(shè)定50 IU/g·原料加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復(fù)配酶處理桂花，復(fù)合酶中β-葡萄糖苷酶與果膠酶酶活之比為1∶1、液料比15∶1 (mL/g)、pH 4.5，分別控制溫度為35，40，45，50，55 ℃處理桂花2 h，考察溫度對(duì)桂花浸膏得率的影響。

(3) 酶解時(shí)間對(duì)桂花浸膏得率的影響：設(shè)定50 IU/g·原料加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復(fù)配酶處理桂花，復(fù)合酶中β-葡萄糖苷酶與果膠酶酶活之比為1∶1、液料比15∶1 (mL/g)、pH 4.5、溫度45 ℃，分別控制酶解時(shí)間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，考察酶解時(shí)間對(duì)桂花浸膏得率的影響。

(4) 液料比對(duì)桂花浸膏得率的影響：設(shè)定50 IU/g·原料加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復(fù)配酶處理桂花，復(fù)合酶中β-葡萄糖苷酶與果膠酶酶活之比為1∶1、pH 4.5、溫度45 ℃，分別控制液料比為5∶1, 10∶1，15∶1，20∶1，25∶1 (mL/g)處理桂花2.5 h，考察液料比對(duì)桂花浸膏得率的影響。

(5) 加酶量對(duì)桂花浸膏得率的影響：設(shè)定復(fù)合酶中β-葡萄糖苷酶與果膠酶酶活之比為1∶1、pH 4.5、溫度45 ℃、液料比20∶1 (mL/g)，分別控制加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復(fù)配酶的量為20，30，40，50，60，70 IU/g·原料處理桂花2.5 h，考察加酶量對(duì)桂花浸膏得率的影響。

(6)β-葡萄糖苷酶比例對(duì)桂花浸膏得率的影響：設(shè)定50 IU/g·原料加入β-葡萄糖苷酶-果膠酶復(fù)配酶處理桂花，pH 4.5、溫度45 ℃、液料比20∶1 (mL/g)，分別控制β-葡萄糖苷酶比例為0%，30%，40%，50%，60%，70%，100%處理桂花2.5 h，考察β-葡萄糖苷酶比例對(duì)桂花浸膏得率的影響。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

以桂花浸膏得率為衡量指標(biāo)，采用響應(yīng)面軟件Design-Expert V8.0進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

顯著性差異分析采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS19。

2 結(jié)果與討論

2.1 多種酶處理對(duì)桂花浸膏得率的影響

試驗(yàn)分別采用果膠酶、葡萄糖苷酶等不同水解酶對(duì)桂花進(jìn)行水解，桂花浸膏得率見圖1。

由圖1可以得出，經(jīng)各種酶處理后所得桂花浸膏的得率差異顯著(P<0.05)。其中，β-葡萄糖苷酶和果膠酶處理桂花所得桂花浸膏得率均高于直接提取，且β-葡萄糖苷酶處理后桂花浸膏得率與直接提取相比提高20.10%，果膠酶處理高于直接提取2.45%。β-葡萄糖苷酶與果膠酶均有助于提高桂花浸膏得率，且最適條件比較接近，本試驗(yàn)選擇β-葡萄糖苷酶和果膠酶復(fù)配對(duì)桂花進(jìn)行酶處理。

2.2 β-葡萄糖苷酶和果膠酶復(fù)配處理對(duì)桂花浸膏得率的影響

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 從圖2可以看出，隨著pH、溫度、酶解時(shí)間、液料比、加酶量以及復(fù)配酶中β-葡萄糖苷酶的比例逐漸增加，桂花浸膏的得率均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)復(fù)合酶總加酶量為50 IU/g，其中β-葡萄糖苷酶比例為50%，液料比20∶1 (mL/g)，在pH 4.5、45 ℃條件下水解桂花2.5 h，桂花浸膏得率可由直接提取的2.04%提高到3.27%，提高了60.29%，遠(yuǎn)高于單一使用β-葡萄糖苷酶以及果膠酶。pH和溫度是影響酶活的2個(gè)重要因素，通過(guò)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)配酶在pH 4.5時(shí)所得桂花浸膏得率最高，該pH值與β-葡萄糖苷酶最適pH一致，但略低于果膠酶的最適pH，可能是復(fù)配酶處理過(guò)程中β-葡萄糖苷酶起主導(dǎo)作用。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)復(fù)配酶在40～50 ℃時(shí)所得桂花浸膏得率均保持較高水平，可能與所使用的工業(yè)酶制劑工作溫度較為寬泛有關(guān)。此外，由于果膠酶可以增加植物細(xì)胞壁的通透性，所以復(fù)配酶中果膠酶的比例較小時(shí)會(huì)影響復(fù)配酶破壞桂花細(xì)胞壁的效果，從而降低浸膏物質(zhì)的提取。

圖1 多種酶處理對(duì)桂花浸膏得率的影響

圖2 各因素對(duì)桂花浸膏得率的影響

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)配酶水解提取桂花浸膏工藝條件

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的六因素三水平的試驗(yàn)條件見表1。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

運(yùn)用Design-Expert V 8.0軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果分別見表3、4。由表3可以得出，模型P值<0.000 1，失擬項(xiàng)P值為0.158 2>0.1，所選模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，因此所選模型可靠。在試驗(yàn)考察的6個(gè)因素中，液料比、pH、處理時(shí)間、酶添加量以及復(fù)配酶中β-葡萄糖苷酶比例5個(gè)因素的P值<0.000 1，其對(duì)桂花浸膏得率影響均顯著。而溫度的P值為0.686 5>0.05，說(shuō)明溫度對(duì)桂花浸膏得率影響不顯著，可能是與所使用的果膠酶以及β-葡萄糖苷酶的作用溫度較為寬泛有關(guān)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

由表4可以得出，模型的R2為0.986 7，R2校正為0.972 9，兩個(gè)值較為接近，且信躁比為30.246>4，可知回歸方程擬合度和可信度均較高，試驗(yàn)誤差較小，故可用此模型對(duì)復(fù)配酶處理制備桂花浸膏的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化與預(yù)測(cè)。

表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design-Expert V8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，忽略影響不顯著因素，得復(fù)配酶法處理桂花所得桂花浸膏得率(Y)的多元二次回歸方程為：

Y=3.29-0.10A+0.083C+0.094D+0.13E-0.050F+0.047AC+0.040AD-0.065AF-0.041CD-0.037CF-0.47A2-0.097B2-0.19C2-0.17D2-0.039E2-0.12F2。

(2)

根據(jù)回歸方程，獲得響應(yīng)曲面圖，選擇交互影響顯著的液料比-pH、液料比-時(shí)間、液料比-β-葡萄糖苷酶比例、pH-時(shí)間以及pH-β-葡萄糖苷酶比例對(duì)桂花浸膏得率的影響，見圖3。

從圖3可以看出，當(dāng)液料比較小時(shí)，由于酶液對(duì)樣品的浸潤(rùn)不足從而影響酶解的效果，所以在試驗(yàn)范圍內(nèi)改變pH、時(shí)間或β-葡萄糖苷酶比例，桂花浸膏得率的變化并不顯著。而由于使用的復(fù)配酶中β-葡萄糖苷酶和果膠酶的最適pH存在一定的差異，所以pH-β-葡萄糖苷酶比例的交互影響就顯得更為顯著。隨著復(fù)配酶中β-葡萄糖苷酶比例的增加，pH值越趨于其最適pH。但是過(guò)高的β-葡萄糖苷酶比例也降低了復(fù)配酶中果膠酶的比例，不利于浸膏物質(zhì)的浸出。而較高的pH值雖然可以有效提高果膠酶的活性，但是會(huì)降低β-葡萄糖苷酶活性，從而減少了糖苷類前體物質(zhì)的釋放，降低浸膏得率。

圖3 pH-液料比、時(shí)間-液料比、β-葡萄糖苷酶比例-液料比、時(shí)間-pH、β-葡萄糖苷酶比例-pH交互影響響應(yīng)曲面圖

Figure 3 Response surface chart of reciprocal effect

利用軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可得模型最佳條件為：pH 4.7、酶解時(shí)間2.6 h、酶解溫度46 ℃、液料比19.8∶1 (mL/g)、復(fù)配酶添加量54.4 IU/g、β-葡萄糖苷酶比例48.1%，桂花浸膏理論得率可達(dá)3.38%。實(shí)驗(yàn)按此最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)3次平行實(shí)驗(yàn)所得桂花浸膏得率為3.32%，相對(duì)誤差為-1.78%，實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值比較接近，可得出此模型可靠。

2.3 復(fù)配酶處理所得桂花浸膏香氣物質(zhì)含量變化

通過(guò)GC-MS對(duì)復(fù)合酶處理所得桂花浸膏及未經(jīng)酶處理直接提取所得桂花浸膏進(jìn)行了檢測(cè)。GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明，鑒定出的化合物主要為醇類、脂肪酸及其酯類、烷烴類、烯烴類以及醛酮類。復(fù)合酶處理所得桂花浸膏共鑒定出有效成分60種，略高于直接提取的58種。且采用復(fù)配酶處理桂花與直接提取相比，浸膏中的組分發(fā)生明顯的變化，其中脂肪酸及其酯類以及醇類化合物的數(shù)量均有所增加。陶清等[18]認(rèn)為決定桂花香氣品質(zhì)的主要成分是醇類、脂肪酸及其酯類。采用β-葡萄糖苷酶和果膠酶復(fù)配處理桂花，有效提高桂花浸膏得率的同時(shí)也提高了桂花浸膏中醇類和脂肪酸及其酯類物質(zhì)的數(shù)量，總體提升了浸膏的品質(zhì)。

復(fù)配酶處理對(duì)桂花浸膏中主要香氣物質(zhì)含量的影響見圖4。桂花浸膏中二氫芳樟醇、β-紫羅蘭酮、γ-癸內(nèi)酯、二氫-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭醇等以游離態(tài)或無(wú)味的糖苷形式存在于植物組織中，具有濃郁的香氣，是桂花主要呈香物質(zhì)[19]。由圖4可知，復(fù)配酶處理對(duì)桂花浸膏中的主要香氣物質(zhì)含量影響較大。桂花浸膏中二氫芳樟醇的含量由未經(jīng)酶處理的0.55%提高到0.70%，增加了27.27%。β-紫羅蘭醇、橙花叔醇未在對(duì)照試驗(yàn)中檢出，但復(fù)配酶處理所得桂花浸膏中β-紫羅蘭醇含量為0.87%，而橙花叔醇含量為0.22%。復(fù)配酶處理后桂花浸膏中γ-癸內(nèi)酯、二氫-β-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮的含量顯著提高，與未經(jīng)酶處理直接提取相比分別提高了116.36%，247.06%，100.00%。復(fù)配酶處理能顯著提高浸膏中香葉醇的含量(P<0.05)，與對(duì)照相比提高了72.84%，并將檸檬烯含量從0.28%提高到0.32%。由此可以得出，β-葡萄糖苷酶可以作用于結(jié)合態(tài)的糖苷前體物質(zhì)，使之生成為游離的芳香物質(zhì)，從而增加浸膏中主要香氣物質(zhì)的含量。而構(gòu)成植物細(xì)胞壁胞間層、次生壁以及初生壁的主要成分是果膠質(zhì)。將β-葡萄糖苷酶和果膠酶進(jìn)行復(fù)配使用，β-葡萄糖苷酶水解釋放桂花香氣物質(zhì)前體，果膠酶水解果膠質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，二者共同作用可以有效地浸出更多的呈香物質(zhì)。

圖4 復(fù)合酶處理對(duì)桂花浸膏主要香氣物質(zhì)含量的影響

3 結(jié)論

本研究在多種風(fēng)味水解酶中優(yōu)選，確定采用β-葡萄糖苷酶和果膠酶復(fù)配對(duì)桂花進(jìn)行酶處理，獲得桂花浸膏。在利用響應(yīng)面試驗(yàn)建立六因素相互作用的數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化復(fù)合酶處理?xiàng)l件提高浸膏得率的同時(shí)，通過(guò)GC-MS聯(lián)用儀檢測(cè)分析了所得桂花浸膏主要香氣物質(zhì)的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶和果膠酶復(fù)配處理桂花制備桂花浸膏得率遠(yuǎn)高于單一酶處理和不經(jīng)酶處理。復(fù)合酶處理所得桂花浸膏得率比直接提取提高了62.75%，提升幅度遠(yuǎn)高于汪海波等[7]使用單一酶處理制備桂花浸膏的。

此外，目前較多的工藝研究主要集中在工藝條件優(yōu)化，提升產(chǎn)量方面，而對(duì)于所得桂花浸膏的品質(zhì)較少涉及。本研究采用β-葡萄糖苷酶和果膠酶復(fù)配處理桂花制備桂花浸膏，在有效提高產(chǎn)量的同時(shí)還有效提升了桂花浸膏的品質(zhì)。與直接提取相比，復(fù)合酶處理所得浸膏中呈香物質(zhì)的數(shù)量顯著提升，二氫-β-紫羅蘭酮、γ-癸內(nèi)酯、二氫芳樟醇、β-紫羅蘭酮、檸檬烯以及香葉醇等主要香氣物質(zhì)的含量提升顯著，分別提高了247.06%，116.36%，27.27%，100.00%，14.29%，72.84%。 本研究充分顯示了β-葡萄糖苷酶和果膠酶復(fù)配在桂花浸膏制備中的應(yīng)用潛力，值得進(jìn)行進(jìn)一步的中試放大研究，探索桂花浸膏制備新工藝。