王 波，周澗楠，黃忠勤，王 幸，丁震乾，常 勇，蘇在興，周興根

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 徐州 221131)

【研究意義】采用植物內(nèi)生菌防治植物病蟲害已有較多的研究和報(bào)道。由于植物內(nèi)生菌從植物體內(nèi)分離得到，它們與宿主植物有密切的互惠共生關(guān)系，具有定殖能力強(qiáng)以及增殖和擴(kuò)散迅速等優(yōu)點(diǎn)，且不易受外界環(huán)境的影響，可以較長時(shí)間地發(fā)揮作用[1-2]，彌補(bǔ)了化學(xué)防治帶來的環(huán)境污染和抗藥性產(chǎn)生等問題，因此，采用植物內(nèi)生菌防控植物病害具有很好的科研和推廣應(yīng)用價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】大豆疫霉病(Phytophthora Root Rot)也叫大豆疫霉根腐病，廣泛分布于世界各大豆主產(chǎn)區(qū)，是一種危害極其嚴(yán)重的土傳性病害，病株率可達(dá)15 %以上，嚴(yán)重地塊發(fā)病率甚至高達(dá)75 %，嚴(yán)重影響了大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。其病原菌Phytophthorasojae可侵染豆莢和根莖葉等組織，引起種子腐爛和幼苗倒伏、植株矮化甚至導(dǎo)致全株枯萎死亡[4]。目前對大豆疫霉病的研究主要集中在抗病品種選育和栽培措施改良以及化學(xué)防治方面，但是由于大豆疫霉病菌具有很高的小種變異性，單一抗性品種的有效期短，對大豆疫霉病不能達(dá)到較好的防效；栽培措施的改良并不能完全控制該病害的發(fā)生和為害；化學(xué)防治對部分生理小種有效，但不是對所有生理小種都能有效，并且化學(xué)防治存在農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及作物抗藥性產(chǎn)生等問題，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。生物農(nóng)藥以其對環(huán)境友好對人畜安全等特點(diǎn)，在卵菌病害防控中已顯示出獨(dú)特優(yōu)勢，劉海龍等[5]從大豆根內(nèi)和根際土壤中分離和篩選到部分生防細(xì)菌對大豆根腐病有較好的防效，且對大豆種子發(fā)芽沒有抑制作用；溫廣月等[6]采用生防細(xì)菌防控該病害并發(fā)現(xiàn)其對大豆具有促生作用；郭榮君等[7]報(bào)道芽孢桿菌BH1對該病害的溫室防效可達(dá)56.1 %，采用生防菌株進(jìn)行大豆疫霉病生物防治已經(jīng)顯示出了較好的應(yīng)用前景。大豆炭疽病(Soybean anthracnose)是大豆重要病害之一，我國各大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。苗期可引起死苗，成株期可危害豆稈、豆莢，導(dǎo)致大豆產(chǎn)量和品質(zhì)降低。選育和利用抗病品種是目前防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，但抗性品種連續(xù)種植幾年以后其抗性便慢慢喪失，最終導(dǎo)致病害暴發(fā)流行。王國榮等人研究發(fā)現(xiàn)始花期與盛花期連續(xù)施用甲基托布津?qū)Υ蠖固烤也〉姆乐涡Ч沙^95 %[8]，但是，長期使用甲基托布津容易產(chǎn)生抗藥性。目前，國內(nèi)鮮有大豆炭疽病生物防治的相關(guān)報(bào)道，更未見多粘類芽孢桿菌用于防治大豆炭疽病的研究報(bào)道。大豆菌核病(Stem rot of soybean)由子囊菌亞門真菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary)引起，該病在我國各大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，在流行年份發(fā)病率可達(dá)60 %～100 %[9-11]，嚴(yán)重影響了大豆的品質(zhì)，是我國大豆生產(chǎn)的重要病害之一，菌核病的發(fā)病部位主要在根莖部，一旦發(fā)病化學(xué)藥劑的防治效果很不理想?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】XZ-2是江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所油料研究課題組從健康大豆植株中分離到的一株內(nèi)生多粘類芽孢桿菌，已有的研究表明XZ-2對大蒜葉枯病菌等8種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性[12]，本文擬進(jìn)一步研究XZ-2的生物學(xué)特性和對3種大豆主要病害的室內(nèi)拮抗作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確菌株生長的最佳環(huán)境條件和對病害的生防潛力，為生防菌發(fā)揮其最佳防效以及生防制劑的研制提供理論依據(jù)，為徐淮地區(qū)大豆病害的綠色防控提供生防資源，為大豆病害生防菌劑的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 生防菌株 生防菌株多粘類芽孢桿菌XZ-2由江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所油料研究課題組從健康大豆植株中分離、篩選和鑒定，并于-20 ℃冰箱中保存。

1.1.2 病原菌 供試病原菌大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌、大豆菌核病菌由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院殺菌劑實(shí)驗(yàn)室饋贈并于PDA斜面4 ℃冰箱保存。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 XZ-2菌株培養(yǎng)使用LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L)和LBA固體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基加瓊脂粉15 g/L)，病原菌對峙試驗(yàn)使用PDA固體培養(yǎng)基(土豆20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L)，將制備好的培養(yǎng)基采用121 ℃高壓滅菌鍋(Zealway GR85DA，America) 20 min后備用。

1.1.4 樣品制備 發(fā)酵液：接種活化好的XZ-2菌液50 μl于25 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖培24 h，待用；發(fā)酵濾液：取發(fā)酵液，10 000 r/min，4 ℃，離心10 min，棄沉淀，得上清液，采用孔徑為0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾得到XZ-2發(fā)酵濾液；病原菌菌碟：將活化的大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌、大豆菌核病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，2～ 3 d后用打孔器打取直徑為6 mm的大豆疫霉病菌菌落邊緣的菌碟備用；4～5 d后打取大豆炭疽病菌菌碟備用；2 d后打取大豆菌核病菌菌碟備用。

1.2 XZ-2的生物學(xué)特性研究

1.2.1 XZ-2生長對O2的需求 深層瓊脂法[13]：將生防細(xì)菌制成菌懸液，微波溶好LBA培養(yǎng)基然后分裝到滅菌試管中，待試管自然冷卻到45～50 ℃時(shí)各吸取100 μl制備好的菌懸液加入試管中，快速搓動試管且避免震蕩導(dǎo)致過多的空氣混入培養(yǎng)基中，待菌液在培養(yǎng)基中混合均勻后，將試管置于冰浴中使培養(yǎng)基迅速凝固。將接種好菌液的試管置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，48 h后開始觀察生長狀況，直至10 d 后結(jié)果清晰為止，試驗(yàn)重復(fù)3 次。根據(jù)在試管中的生長部位，判斷該生防菌株對O2的需求。分類依據(jù)如下：好氧菌只在培養(yǎng)基表面生長；微好氧菌在培養(yǎng)基中部生長；兼性厭氧菌在培養(yǎng)基接近表面及上部生長旺盛，中下部也有少量生長；專性厭氧菌只在培養(yǎng)基底部生長；耐氧厭氧菌在培養(yǎng)基中均勻生長。

1.2.2 pH值對XZ-2生長的影響 設(shè)5～12等8個(gè)梯度，用0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)LB 培養(yǎng)基的pH值。用三角瓶分別取25 mL各梯度pH的培養(yǎng)基，接種50 μl XZ-2種子液到各三角瓶中，每處理均設(shè)3次重復(fù)，28 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)24 h后記錄OD600。

1.2.3 氯化鈉濃度對XZ-2生長的影響 以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中NaCl稱取量分別設(shè)置0，5，10，15，20和25 g/L等6個(gè)梯度，接種50 μl XZ-2種子液到各三角瓶中，每處理均設(shè)3次重復(fù)，28 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)24 h后記錄OD600。

1.2.4 光照條件對XZ-2生長的影響 接種50 μl XZ-2種子液到LB培養(yǎng)基中，分別設(shè)置光照、黑暗和12 h光照12 h黑暗光暗交替3個(gè)處理，每處理均設(shè)3次重復(fù)，28 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)24 h后記錄OD600。

1.2.5 XZ-2致死溫度測定 設(shè)置45、50、55、60、65、70、75、80、90和100 ℃共10 個(gè)溫度梯度，無菌條件下取100 μl XZ-2種子液置入1.5 mL滅菌離心管中蓋好，分別水浴10 min，然后取出涂板，將處理好的平板置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d以上，觀察有無菌落長出，根據(jù)菌落生長與否，確定致死溫度，每處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.3 拮抗活性測定

拮抗活性測定方法參考Yang等[14]方法，此處不再贅述，每個(gè)處理3個(gè)平板即3次重復(fù)，將接種好的平板置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照中兩病原菌菌絲交接時(shí)，測定抑菌帶直徑并記錄分析。

1.4 受拮抗的病原菌菌絲及孢子顯微觀察

采用倒置顯微鏡(Leica DMILLED，Germany)觀察XZ-2發(fā)酵濾液對大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌、大豆菌核病菌菌絲形態(tài)的影響，以及對大豆炭疽病菌產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響，以清水處理為對照，每處理3次重復(fù)，記錄并拍攝照片[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 XZ-2的生物學(xué)特性

2.1.1 XZ-2生長對O2的需求 從48 h至10 d連續(xù)每天觀察XZ-2在試管內(nèi)的生長狀況，發(fā)現(xiàn)XZ-2在深層瓊脂培養(yǎng)基接近表面及上部生長旺盛，中下部也有少量生長，因此鑒定XZ-2為兼性厭氧菌。

圖1 不同pH值對XZ-2生長的影響Fig.1 Effect of different pH on the growth of XZ-2

圖2 不同濃度NaCl對XZ-2生長的影響Fig.2 Effect of different concentration of NaCl on the growth of XZ-2

2.1.2 pH 值對XZ-2生長的影響 從圖1可以看出，在pH 5～12等8個(gè)梯度的LB液體培養(yǎng)基中，XZ-2在pH 6，7，8的培養(yǎng)基中生長最好，菌液OD600分別為0.359，0.375，0.377；在pH 5的條件下生長較差，菌液OD600為0.206；pH 9，10，11，12時(shí)菌液OD600值迅速降低，分別為0.048，0.0477，0.0477，0.0477，說明該菌株在pH 9以上基本不生長。

2.1.3 氯化鈉濃度對XZ-2生長的影響 如圖2所示，XZ-2隨著氯化鈉濃度的增加，其生長逐漸被抑制。在供試的6種氯化鈉梯度濃度的LB液體培養(yǎng)基中，XZ-2在氯化鈉濃度為0～15 g/L的生長情況相對較好，菌液OD600分別為0.365，0.345，0.345，0.328；在氯化鈉濃度為20 g/L時(shí)菌液OD600為0.292；在氯化鈉濃度為25 g/L時(shí)生長最差，菌液OD600為0.219。

2.1.4 光照條件對XZ-2生長的影響 從圖3可以看出，XZ-2在24 h黑暗條件下生長最好，菌液OD600為0.318；其次為12 h光暗交替的條件，菌液OD600為0.309；在24 h光照的條件下生長最差，菌液OD600為0.293，總體而言，該菌株對光照的敏感性不強(qiáng)。

2.1.5 XZ-2致死溫度 調(diào)查結(jié)果顯示，經(jīng)過90 ℃以下溫度水浴處理10 min后涂板，在LBA上仍能長出菌落，而經(jīng)過100 ℃，10 min處理后涂板，看不到菌落的形成，由此鑒定該菌株的致死溫度為100 ℃，10 min。

1.12 h光照和12 h黑暗；2.24 h光照；3.24 h黑暗1.12 hours light and 12 hours dark; 2.24 hours light; 3.24 hours dark圖3 不同光照處理對XZ-2生長的影響Fig.3 Effect of different light treatments on the growth of XZ-2

2.2 XZ-2拮抗活性測定

待對照中兩病原菌菌絲交接時(shí)，測定抑菌帶直徑(表1)，XZ-2對供試的3種大豆主要病害的病原菌均有較強(qiáng)的抑制活性，對大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌和大豆菌核病菌的抑菌帶直徑分別為22.3、24.2和23.6 mm。抑菌照片如圖4所示，說明XZ-2對3種供試大豆病原真菌抑制效果很強(qiáng)，均顯示出了非常明顯的抑菌帶。

表1 XZ-2對3種大豆病原菌的拮抗活性

2.3 XZ-2對3種大豆病原菌的菌絲形態(tài)及孢子萌發(fā)的影響

2.3.1 XZ-2發(fā)酵濾液對大豆疫霉病菌的菌絲形態(tài)的影響 顯微鏡觀察(圖5)表明，對照菌絲纖細(xì)光滑，粗細(xì)均勻，末端尖細(xì)，而經(jīng)菌株XZ-2發(fā)酵濾液處理的菌絲膨大、畸形，分枝增多。

2.3.2 XZ-2發(fā)酵濾液對大豆炭疽病菌的菌絲形態(tài)以及孢子萌發(fā)的影響 顯微鏡觀察(圖6)表明，對照菌絲纖細(xì)光滑，粗細(xì)均勻，末端尖細(xì)，而經(jīng)XZ-2發(fā)酵濾液處理的菌絲則膨大、畸形，出現(xiàn)原生質(zhì)濃縮和內(nèi)含物釋放的現(xiàn)象，發(fā)酵液處理的孢子不能正常萌發(fā)，并且經(jīng)發(fā)酵濾液處理后的菌絲產(chǎn)孢數(shù)量明顯少于對照(圖7)，說明XZ-2還可以抑制大豆炭疽病菌孢子的產(chǎn)生。

4-A, 4-B, 4-C的指示病原菌分別為大豆疫霉病菌，大豆炭疽病菌，大豆菌核病菌；每個(gè)圖中左邊平板為對照，右邊平板為XZ-2處理4-A, 4-B and 4-C represented as antibiotic activity of XZ-2 against Phytophthora sojae, Glomerella glycines and Sclerotinia sclerotiorum, in each figure the left pictures represented as control and the right pictures represented as pathogens treated by XZ-2圖4 XZ-2的拮抗活性測定Fig.4 Analysis of antibiotic activity of XZ-2

5-A: 對照；5-B: XZ-2發(fā)酵液處理后的菌絲膨大，畸形；5-C：XZ-2發(fā)酵液處理后的菌絲分枝增多5-A: Control; 5-B: Hyphae treated by fermentation liquid of XZ-2 were swelled and deformed; 5-C: Branches of hyphae treated by fermentation liquid of XZ-2 increased圖5 XZ-2發(fā)酵濾液對大豆疫霉病菌的菌絲形態(tài)的影響Fig.5 Effects of fermentation liquid of XZ-2 on hyphae morphology of Phytophthora sojae

6-A: 對照，Control; 6-B: XZ-2發(fā)酵液處理后的菌絲膨大，畸形6-A: Control; 6-B: Hyphae treated by fermentation liquid of XZ-2 were swelled and deformed圖6 XZ-2發(fā)酵濾液對大豆炭疽病菌的菌絲形態(tài)的影響Fig.6 Effects of fermentation liquid of XZ-2 on hyphae morphology of Glomerella glycines

7-A: 對照，Control; 7-B: XZ-2發(fā)酵液處理后的孢子基本不萌發(fā)7-A: Control; 7-B: Spores treated by fermentation liquid of XZ-2 nearly ungerminated圖7 XZ-2發(fā)酵濾液對大豆炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.7 Effects of fermentation liquid of XZ-2 on spores germination of Glomerella glycines

2.3.3 XZ-2發(fā)酵濾液對大豆菌核病菌的菌絲形態(tài)的影響 顯微鏡觀察(圖8)表明，對照菌絲纖細(xì)光滑，粗細(xì)均勻，末端尖細(xì)，而經(jīng)菌株XZ-2 發(fā)酵濾液處理過的菌絲膨大、畸形，菌絲分枝增多。

3 討 論

生防因子的穩(wěn)定性對于生防效果至關(guān)重要，抗生因子在土壤中的有效存活期是生防因子保持穩(wěn)定拮抗活性的關(guān)鍵因素之一。因此，生防菌劑引入到土壤環(huán)境之前，應(yīng)該首先考慮對土壤環(huán)境的適應(yīng)性[15]，適宜的環(huán)境能使生防菌在根系中較長時(shí)間內(nèi)保持較高的種群密度。本課題組前期從江蘇省徐州市銅山區(qū)班井村健康大豆植株中分離篩選得到的拮抗效果較好的生防菌株XZ-2。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明該菌株在pH 6～8生長情況最佳，但是pH 8以上該菌株基本不生長，說明該菌株耐弱堿性；在氯化鈉濃度為0～15 g/L的生長情況相對較好，在氯化鈉濃度為25 g/L的情況下仍然可以較好的生長；致死溫度為100 ℃，10 min，說明該菌株具有較好的高鹽和高溫抗性。明確生防因子對環(huán)境因子(如pH、鹽堿地、需氧量等)適應(yīng)能力，可為該生防菌株的應(yīng)用生態(tài)環(huán)境的選擇提供理論依據(jù)。拮抗活性測定顯示該菌株對引起大豆主要病害的大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌和大豆菌核病菌均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑均達(dá)到20 mm以上。顯微觀察發(fā)現(xiàn)XZ-2發(fā)酵濾液可導(dǎo)致病原菌的菌絲膨大，畸形以及分枝增多，并且該菌株可抑制大豆炭疽病孢子產(chǎn)生和孢子萌發(fā)。

8-A：對照；8-B：XZ-2發(fā)酵液處理后的菌絲膨大，畸形；8-C：XZ-2發(fā)酵液處理后的菌絲分枝增多8-A: Control; 8-B: Hyphae treated by fermentation liquid of XZ-2 were swelled and deformed; 8-C: Branches of hyphae treated by fermentation liquid of XZ-2 increased圖8 XZ-2發(fā)酵濾液對大豆菌核病菌的菌絲形態(tài)的影響Fig.8 Effects of fermentation liquid of XZ-2 on hyphae morphology of Sclerotinia sclerotiorum

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)表明XZ-2是1株具有很好的生防應(yīng)用前景的菌株。下一步將開展大豆病害田間防治試驗(yàn)，針對Yim等[16]關(guān)于生防菌Methylobacteriumspp.可以調(diào)控番茄中病程相關(guān)蛋白(pathogenesis- related protein，PRs)基因表達(dá)的相關(guān)報(bào)道，還將對XZ-2處理的大豆植株進(jìn)行病程相關(guān)蛋白基因的時(shí)空表達(dá)分析，探索該菌株是否能誘導(dǎo)植物抗病性的產(chǎn)生，為進(jìn)一步研究XZ-2 的生防機(jī)理奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，對大豆促生作用、產(chǎn)量及品質(zhì)影響以及對大豆根圍土壤微生物生態(tài)多樣性的調(diào)節(jié)進(jìn)行研究，為該菌株的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。