徐齊君，扎 桑，王玉林，原紅軍，曾興權(quán)，尼瑪扎西

(1. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所,西藏 拉薩 850002; 2. 省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西藏 拉薩 850002; 3. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院,西藏 拉薩 850002)

【研究意義】青稞(HordeumvulgareL. var. nudum HK.f.)為禾本科大麥屬，又名裸大麥、米大麥，為藏族人民主要糧食作物。青稞主要生長(zhǎng)在海拔高、溫度低、日照長(zhǎng)、晝夜溫差大的地區(qū)，對(duì)環(huán)境的抗逆性較強(qiáng)[1]。近些年來(lái)，研究者們先后對(duì)青稞的抗鹽性[2-3]、抗旱性[4-5]等方面進(jìn)行了研究，以期明確青稞的抗逆機(jī)制，篩選出有應(yīng)用價(jià)值的基因，為提高青稞的產(chǎn)量和質(zhì)量，選育出抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良品種提供理論依據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前期研究中，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和抑制性差減雜交技術(shù)對(duì)青稞的抗寒相關(guān)基因進(jìn)行了篩選，其中，核糖體蛋白基因RPL19(GeneBank登錄號(hào): AK361587)位列其中[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】核糖體蛋白主要有70S和80S 2種類型，70S存在于細(xì)菌、線粒體和葉綠體中，分50S和30S 2個(gè)亞基；80S核糖體存在于真核生物的細(xì)胞質(zhì)中，分60S和40S 2個(gè)亞基[7]。研究表明，核糖體蛋白除組成核糖體參與蛋白質(zhì)合成外，還通過(guò)參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)等作用于細(xì)胞的分裂、增殖、分化、發(fā)育調(diào)控等多種生命過(guò)程[8-10]。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)得到的青稞RPL19基因的初步分析顯示，該基因編碼一個(gè)50S葉綠體核糖體蛋白。為進(jìn)一步了解該基因的相關(guān)信息，以青稞為材料，進(jìn)行RPL19基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)，旨在為進(jìn)一步了解RPL19的功能，明確其與青稞的抗寒相關(guān)性方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

青稞種質(zhì)‘喜馬拉雅8號(hào)’和‘青稞320’由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 青稞種苗轉(zhuǎn)錄本的提取及反轉(zhuǎn)錄 取適量的青稞種子播種于富含有機(jī)質(zhì)的盆栽土壤中，正常澆水管理，待植株生長(zhǎng)至正常大小時(shí)，采用Jena InnuPREP RNA Mini Kit提取新鮮葉片RNA，采用TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA樣本-20 ℃保存。

1.2.2HbRPL19基因的克隆 以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異引物RPL19-F：5′- ATTGCGGGATCCATGCAGTCTTTAGTGC -3′，RPL19-R：5′- ATCTCGCTCGAGTCAT TTCTTGAGTGCATTC -3′，下劃線分別為BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)。RT-PCR反應(yīng)在S-1000 Thermal Cycler進(jìn)行，反應(yīng)體系采用20 μl PCR擴(kuò)增體積：TaqDNA聚合酶(TaKaRa，5 U/μl) 0.2 μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液(Takara) 2 μl，dNTP(10 mmol/L)1.6 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，cDNA 2 μl，滅菌水12.6 μl。反應(yīng)條件：94 ℃變性4 min，94 ℃變性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，34循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；厥漳繕?biāo)片段，克隆、測(cè)序。

1.2.3HbRPL19基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)、ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、DISPHOS(http://www.dabi.temple.edu/disphos/)、InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)、Conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Signal IP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、PredictProtein(https://ppopen.rostlab.org/)、NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)等網(wǎng)絡(luò)資源對(duì)HbRPL19進(jìn)行序列分析。根據(jù)推測(cè)的HbRPL19氨基酸序列，利用MEGA5.1軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 挑選測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，采用BamHI和XhoI分別雙酶切陽(yáng)性重組質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)，凝膠回收目標(biāo)片段，使用T4DNA連接酶與16 ℃連接過(guò)夜，挑單克隆震蕩培養(yǎng)后提質(zhì)粒，酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒。將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒pET28a-RPL19轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)將提取的空載體pET-28a(+)轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)作陽(yáng)性對(duì)照，BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞不轉(zhuǎn)化組作陰性對(duì)照。

1.2.5 蛋白的誘導(dǎo)及檢測(cè) 分別挑單克隆接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含Kan 100 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5時(shí)，取1 mL按1∶100比例接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中；將培養(yǎng)的100 mL培養(yǎng)液分為2份，其中1份加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，另1份不加IPTG作為對(duì)照，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8 h。取IPTG誘導(dǎo)后菌液1 mL，離心，棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌后，加入100 μl生理鹽水及5×SDS上樣緩沖液25 μl，100 ℃煮沸10 min，離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE。對(duì)未誘導(dǎo)菌液做同樣處理，觀察表達(dá)情況。同時(shí)將LB液體培養(yǎng)未轉(zhuǎn)化及空載體pET28a(+)轉(zhuǎn)化的BL21作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbRPL19基因的克隆

以電子克隆延伸得到的序列(GeneBank登錄號(hào): AK361587)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增青稞苗期葉片的cDNA，獲得1個(gè)條帶654 bp的cDNA序列(圖1)，測(cè)序分析顯示該片段為預(yù)期的HbRPL19基因CDS全長(zhǎng)。

圖1 HbRPL19基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of HbRPL19

2.2 HbRPL19基因的序列分析

用ORFfinder在線分析顯示，HbRPL19基因CDS全長(zhǎng)654 bp，編碼1個(gè)217個(gè)氨基酸的多肽(圖2)。ProtParam分析表明，HbRPL19基因編碼的多肽相對(duì)分子質(zhì)量為24.47 KD，理論等電點(diǎn)(pI)為10.42，分子式為C1082H1791N327O302S8，總平均親水性(GRAVY)為-0.353，不穩(wěn)定系數(shù)為53.46，編碼的217個(gè)氨基酸中，包括21個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)，40個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)，其余氨基酸為非極性、疏水性氨基酸和極性、中性氨基酸，表明該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。Disphos預(yù)測(cè)表明，HbRPL19存在29個(gè)磷酸化位點(diǎn)(包括12個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，13個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn))，其中，只有1個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有功能(第86個(gè)氨基酸)。應(yīng)用InterProScan和NCBI網(wǎng)站的Conserved domains分析顯示，HbRPL19蛋白存在典型的SH3-like結(jié)構(gòu)域和核糖體蛋白L19結(jié)構(gòu)域(圖3)。

圖2 HbRPL19基因的CDS序列和推測(cè)氨基酸序列Fig.2 CDS and amino acid sequence of HbRPL19

圖3 HbRPL19蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Domain analysis of HbRPL19 protein

圖4 HbRPL19的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Systematic evolutionary analysis of HbRPL19

TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白不含跨膜轉(zhuǎn)移功能區(qū)。Signal IP3.0 預(yù)測(cè)該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。PredictProtein亞細(xì)胞定位證實(shí)該基因所編碼蛋白位于葉綠體內(nèi)。

Blastn分析發(fā)現(xiàn)，HbRPL19基因序列與山羊草、二穗短柄草、小米和高粱等植物的RPL基因全長(zhǎng)cDNA序列相似度分別為94 %、87 %、85 %和84 %，推導(dǎo)的氨基酸序列同源比對(duì)分析結(jié)果表明，該基因與小麥、山羊草、二穗短柄草、水稻、小米等植物相似度分別為94 %、93 %、82 %、74 %、72 %?；诎被嵝蛄械南到y(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，青稞HbRPL19蛋白(GeneBank登錄號(hào)：BAJ87120)與小麥和山羊草具有較近的親緣關(guān)系(圖4)。

NPS二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，72個(gè)氨基酸屬于α螺旋，占33.18 %；50個(gè)氨基酸為延伸鏈，占23.04 %；19個(gè)氨基酸屬于β折疊，占8.76 %；76個(gè)氨基酸屬于無(wú)規(guī)則卷曲，占35.02 %。應(yīng)用SWISS-MODEL建立該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖5 所示。

2.3 HbRPL19基因的原核表達(dá)

利用BamH I和XhoI雙酶切重組質(zhì)粒，結(jié)果切出的片段與預(yù)期大小相同(圖6a)，進(jìn)一步的測(cè)序分析顯示，HbRPL19插入片段完全正確，未發(fā)生任何堿基突變。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8 h后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示融合蛋白誘導(dǎo)成功，與預(yù)期大小(24.47 KD)相近，融合蛋白主要存在于菌體沉淀中，上清中含量極少(圖6b)，表明得到的HbRPL19誘導(dǎo)蛋白主要以包涵體形式存在。

3 討 論

中國(guó)國(guó)土面積遼闊，地形復(fù)雜，培育適于各種極端環(huán)境條件且高產(chǎn)優(yōu)產(chǎn)的農(nóng)作物是我們持之以恒的目標(biāo)。青稞可以在青藏高原高海拔高寒的極端條件下生長(zhǎng)良好，對(duì)環(huán)境有優(yōu)良的適應(yīng)性，同時(shí)青稞自身具有一定的保健價(jià)值。因此，對(duì)于青稞這一特殊種植資源的利用具有很大的價(jià)值。同時(shí)，由于青稞屬禾本科，研究其遺傳背景對(duì)于選育高產(chǎn)優(yōu)產(chǎn)抗寒的農(nóng)作物具有重要意義。

a中h:α螺旋，e:延伸鏈，t: β折疊，c:無(wú)規(guī)則卷曲h: alpha helix, e: extended strand, t: beta turn, c: random coil圖5 HbRPL19蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of secondary structure and tertiary structure of HbRPL19 protein

圖6 pET28a-RPL19重組質(zhì)粒的雙酶切和重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.6 Double digestion of recombinant plasmid pET28a-RPL19 and SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

葉綠體核糖體是植物特有的細(xì)胞器核糖體，主要功能是作為一個(gè)平臺(tái)，在這個(gè)平臺(tái)上，mRNA，tRNA和各種蛋白合成因子相繼組裝，來(lái)執(zhí)行譯碼和催化肽鏈的合成，負(fù)責(zé)著質(zhì)體基因編碼的不到100個(gè)蛋白的合成。葉綠體核糖體由30 S和50 S兩個(gè)亞基構(gòu)成，包含rRNA和50～100種獨(dú)特的蛋白[7]。在組成和行使功能的方式上，葉綠體核糖體與細(xì)菌的70 S核糖體非常相似，大部分葉綠體核糖體蛋白在大腸桿菌核糖體中都可以找到同源蛋白，其大約有45 %的平均序列一致性[11-12]。目前，葉綠體核糖體中rRNAs已經(jīng)被完全確定，核糖體蛋白的功能也逐漸開(kāi)始了相關(guān)研究[13-19]。顧志敏等[20]首次從單子葉的模式植物水稻中克隆了核糖體蛋白質(zhì)S7基因，證明核糖體蛋白質(zhì)在進(jìn)化過(guò)程中的高度保守性。Yao等[21]成功分離了小麥中的15個(gè)核糖體蛋白質(zhì)基因，并分析了其序列特性并進(jìn)行了表達(dá)模式的檢測(cè)。本研究克隆得到的青稞HbRPL19屬于葉綠體核糖體50 S亞基的組成蛋白，其功能尚不清楚。我們?cè)诓捎棉D(zhuǎn)錄組測(cè)序和抑制性差減雜交技術(shù)對(duì)青稞的抗寒相關(guān)基因進(jìn)行篩選的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，HbRPL19包含其中，推測(cè)其與青稞的抗寒性相關(guān)。因此，對(duì)HbRPL19基因進(jìn)行了進(jìn)一步的克隆和序列分析，同時(shí)，進(jìn)行了原核表達(dá)，探究其在體外的表達(dá)情況。

4 結(jié) 論

在本研究中，我們成功獲得了青稞HbRPL19基因CDS全長(zhǎng)序列及其編碼蛋白，為進(jìn)一步研究HbRPL19蛋白與其它葉綠體內(nèi)的蛋白質(zhì)互作關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。