張進(jìn)忠，孫嘉曼，李朝生，劉挺燕，范燕萍

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；3. 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】食用百合地下鱗莖富含淀粉，是人們青睞的食材。百合鱗莖的形成、發(fā)育、生長(zhǎng)與其淀粉、糖的合成與分解代謝密切相關(guān)[1]，其繁殖過(guò)程依賴(lài)于鱗片再生種球，更依賴(lài)于淀粉的合成代謝，作為繁殖材料，鱗莖種球的膨大發(fā)育與淀粉的合成積累成正相關(guān)[2-3]；在淀粉合成關(guān)鍵酶中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)被認(rèn)為是淀粉合成的限速酶[4]，該酶與尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)酶偶聯(lián)，形成了蔗糖經(jīng)萄糖-1-磷酸(G-1-P)形式轉(zhuǎn)化為腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)的合成路線，所生成的ADPG做為淀粉合酶的底物形成糖苷鍵延長(zhǎng)合成淀粉。因此，AGPase對(duì)于以淀粉為收獲物的作物非常關(guān)鍵，對(duì)其基因的作用機(jī)理和調(diào)節(jié)模式進(jìn)行相關(guān)研究，探索出能提高生物淀粉產(chǎn)量、改善淀粉品質(zhì)的技術(shù)有利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】AGPase基因表達(dá)與生物淀粉的合成積累已有相關(guān)研究，一般認(rèn)為其在植物體內(nèi)過(guò)表達(dá)能顯著提高淀粉合成速率與含量，而反義調(diào)節(jié)則顯著下調(diào)其合成[5-7]，然而對(duì)其具體作用的分子機(jī)理雖有報(bào)道，但仍知之甚少。在AGPase蛋白酶的多態(tài)性研究結(jié)果表明不同作物的AGPase酶存在多態(tài)性，所執(zhí)行的功能各異，但都與淀粉合成有關(guān)；通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型馬鈴薯中存在5種類(lèi)型的AGPase酶，當(dāng)酶為ISQV類(lèi)型時(shí)，淀粉合成明顯高于其他拷貝類(lèi)型[8]；岳向文等[9]通過(guò)凝膠電泳鑒定出了60個(gè)小麥品種5種AGPase基因型，其中AGPabcd基因型酶活與淀粉含量最高，且各基因型具有不同的遺傳效應(yīng)，AGPase大亞基的某些單核苷酸多態(tài)性(SNP)與穗粒數(shù)和千粒重密切相關(guān)[10]；在對(duì)AGPase與木薯淀粉積累關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，木薯AGPase具有4種同工酶，其中AGPa、AGPb、AGPc基因型能顯著影響木薯塊根的淀粉積累[11]；在水稻AGPase酶研究中發(fā)現(xiàn)了7種同工酶基因型，其中AGPS2b、AGPL2、AGPL3表達(dá)較強(qiáng)，是水稻胚乳中AGPase基因表達(dá)的主要形式[12]。涉及AGPase其他功能的研究目前較多。RNAi是研究基因功能、探索基因表達(dá)信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要工具，在多種作物上進(jìn)行基因功能的鑒定及創(chuàng)制新種質(zhì)研究中發(fā)揮著重要作用。其通過(guò)RNAi沉默HMA2基因，闡明其介導(dǎo)鎘長(zhǎng)距離運(yùn)輸在馬藺適應(yīng)重金屬鎘污染環(huán)境中的作用機(jī)制[13]，構(gòu)建沉默木薯eIF4E7基因的干擾載體，使木薯褐色條斑病毒與烏干達(dá)木薯褐色條斑病毒侵染時(shí)缺少翻譯起始因子，從而達(dá)到抗病毒的目的[14]；通過(guò)RNAi過(guò)抑制大豆內(nèi)源GmPEPc基因表達(dá)，增加油脂積累，獲得高油的轉(zhuǎn)基因大豆新品種[15]，這些表明RNAi技術(shù)在研究基因功能和創(chuàng)新抗逆性、高品質(zhì)種質(zhì)有巨大的潛力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】食用百合淀粉合成酶類(lèi)基因與百合繁殖方式——鱗莖形成、膨大發(fā)育密切相關(guān)，而目前關(guān)于此類(lèi)基因的研究非常少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用Gateway基因沉默技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建保守區(qū)域干擾表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化植株，探索AGPase轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)情況，為該基因功能的進(jìn)一步研究及今后百合組培鱗莖膨大繁育基因調(diào)控技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)組培苗，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒載體 農(nóng)桿菌GV3101(pMP90RK)感受態(tài)，大腸桿菌DH5α；入門(mén)載體pDONR221，目的載體pJawohl8-RNAi，具有AGPase基因(登錄號(hào)：KP751443)的pMD18-T克隆質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 GatewayTMBP ClonaseTMII Enzyme mix，規(guī)格100T，貨號(hào)11789100(Invitrogen)；GatewayTMLR ClonaseTMEnzyme mix：規(guī)格20T，貨號(hào)11791019(Invitrogen)；TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa，RNA提取試劑Trizol購(gòu)于Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit：規(guī)格20T，貨號(hào)K1621(Thermo Scientific)；DNA凝膠回收試劑盒AP-GX-50購(gòu)于Axygen；PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)、SYBR Premix ExTaqTMII(Perfect Real Time)購(gòu)于TAKARA；其余常規(guī)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的序列的擴(kuò)增 根據(jù)基因序列，選擇中間300 bp保守區(qū)域作為干擾片段，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，其中通用引物為：

TF:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGG CT-3′

TR:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG GT-3′

含部分attB接頭的基因特異性引物為：

F:5′-AAAAAGCAGGCTTGAAGGAATTCggtaccG AGAACCCCAACTGGTTTCAGGG-3′，酶切位點(diǎn)Acc65I；

R:5′-AGAAAGCTGGGTTGCGGCCGCActcgag G GGGTATCAACCTTCATTGCCTTC-3′，酶切位點(diǎn)XhoI。

以帶有目的片段的質(zhì)粒為模板，加含有部分attB接頭的基因特異性引物(F、R)，進(jìn)行第1輪PCR，然后以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，加入通用引物，進(jìn)行第2輪PCR。

PCR反應(yīng)程序如下：將下列試劑于冰盒中溶解，并按以下次序?qū)⒏鹘M分在PCR管內(nèi)混勻：模板1 μl，10×Buffer 5 μl，2 mM dNTP 5 μl，正反向引物各4 μl，25 mM MgCl23 μl，Taq1 μl，ddH2O 26 μl。擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物并純化。

1.2.2 構(gòu)建入門(mén)克隆(將PCR產(chǎn)物構(gòu)建進(jìn)入門(mén)載體中) ①BP重組反應(yīng)。反應(yīng)體系組分如下：attB-PCR產(chǎn)物5 μl(>10 ng)，pDONR221(150 ng/μl)1 μl，5×BP Clonase enzyme mix 2 μl，TE Buffer 4 μl。反應(yīng)體系放于25 °C下溫育10 h，反應(yīng)終止后，加2 μl的Proteinase K(2 μg/μl)在37 °C下處理10 min。反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)為含有目的片段的入門(mén)克隆pDONR-AGPase。②轉(zhuǎn)化。取100 μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入至上述反應(yīng)體系中，冰上30 min，然后42 ℃水浴熱擊90 s，迅速放于冰上2 min，涂布到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)皿上，37 ℃培養(yǎng)15 h。③PCR法篩選重組克隆。將LB平板倒置，常溫下隨機(jī)挑選平板上的陽(yáng)性克隆并編號(hào)。每個(gè)PCR管里分裝16 μl ddH2O和正反向載體引物1 μl(5 pmol/μl)，用槍頭在LB平板上輕點(diǎn)取轉(zhuǎn)化菌，然后將沾有菌體的槍頭置于相應(yīng)的PCR管中吹打數(shù)次使其混合；將PCR其他組分配成PCR mix分裝于每個(gè)PCR管中，總體積達(dá)到25 μl，然后混勻，蓋緊管子。PCR mix配方如下：10×TaqReaction Buffer(Mg plus)2.5 μl，dNTP(10 mM)0.5 μl，Taq(5 U/μl)0.2 μl，ddH2O 4.8 μl。將混有菌體的PCR混合物短暫離心后置于PCR儀中，PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.3 構(gòu)建干擾表達(dá)載體(將入門(mén)克隆中的目的基因轉(zhuǎn)移至目的載體) ①LR重組反應(yīng)。將下列試劑于冰盒中溶解，并按以下次序?qū)⒏鹘M分在1.5 mL離心管內(nèi)混勻(總體積20 μl)：pDONR-AGPase(≥100 ng/μl)3 μl，LR ClonaseTMReaction Buffer 4 μl，5×LR ClonaseTMenzyme mix 4 μl，pJawohl8-RNAi(≥300 ng/μl)1 μl，ddH2O 8 μl。移液槍混勻后并短暫離心，置于25 ℃下孵育過(guò)夜。加2 μl的Proteinase K(2 μg/μl)在37 °C下處理10 min。反應(yīng)物應(yīng)為含有正反向AGPase片段且中間有內(nèi)含子的干擾表達(dá)載體：pJawohl8-RNAi-AGPase，取5 μl用于轉(zhuǎn)化。②轉(zhuǎn)化。取100 μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入至上述反應(yīng)體系中，冰上孵育30 min，然后42 ℃水浴熱擊90 s，迅速回放于冰上2 min，涂布到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)皿上，37 ℃培養(yǎng)15 h。③PCR法篩選重組克隆。將LB平板倒置，常溫下隨機(jī)挑選平板上的陽(yáng)性克隆并編號(hào)。每個(gè)PCR管里分裝16 μl ddH2O和正反向載體引物1 μl(5 pmol/μl)，用槍頭在LB平板上輕點(diǎn)取菌；將沾有菌體的槍頭置于相應(yīng)的PCR管中吹打數(shù)下。將PCR其他組分配成PCR mix分裝于每個(gè)PCR管里，使總體積達(dá)到25 μl，然后混勻，蓋緊管子。PCR mix配方同上。將混有菌體的PCR混合物短暫離心后置于PCR儀中，PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，選擇出含目的片段的陽(yáng)性克隆，再進(jìn)行Acc65I、NheI與SpeI酶切鑒定。④重組質(zhì)粒測(cè)序。挑選陽(yáng)性克隆接種到5 mL LB/含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37 °C搖床培養(yǎng)15 h，提取質(zhì)粒送測(cè)序。

1.2.4 干擾載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 取出農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞于冰上凍融；加2 μl所構(gòu)建的干擾載體質(zhì)粒于100 μl感受態(tài)細(xì)胞中，用槍頭輕輕攪拌混勻；取出細(xì)胞與質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)入電擊杯中，在2500 V高壓下電擊；取出電擊杯，加入500 μl預(yù)冷的YEB培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，吸出菌液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)5 h。取30 μl轉(zhuǎn)化的菌液涂在含相應(yīng)抗生素的YEP培養(yǎng)基平板上(含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平)，28 ℃避光倒置培養(yǎng)2 d后長(zhǎng)出菌落，用接種環(huán)挑取單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中(含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平)，震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。用特異引物進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 遺傳轉(zhuǎn)化和篩選 取培養(yǎng)好的百合愈傷組織，用鋒利手術(shù)刀片將愈傷組織切成0.5 cm2的小塊(帶有傷口)，備用。取培養(yǎng)過(guò)夜的含有干擾載體的GV3101菌液，4000 r/min，室溫離心10 min，用MS鹽溶液重新懸浮菌體，使用時(shí)用MS鹽溶液稀釋至原體積的20倍。將準(zhǔn)備好的組培塊在菌液中侵染10 min后取出，無(wú)菌濾紙吸去植物材料表面菌液，轉(zhuǎn)移到鋪有一層無(wú)菌濾紙的MS培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)，共培養(yǎng)3 d。共培養(yǎng)后將材料轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L)上培養(yǎng)，28 ℃，光周期8L∶16D，直至長(zhǎng)出新苗。

1.2.6 轉(zhuǎn)化植株的熒光定量PCR檢測(cè) 以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒農(nóng)桿菌GV3101的百合苗為對(duì)照，熒光定量PCR檢測(cè)經(jīng)農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化的含有AGPase干擾載體的植株AGPase基因相對(duì)表達(dá)量；取各處理的葉片下部膨大組織，使用TRIzol Reagent試劑盒抽提植物組織mRNA，使用PrimeScript RT Master Mix將mRNA擬轉(zhuǎn)錄成cDNA，特異性引物為：

18s F: 5′-TTCATATCACGTGCTGCATGG-3′

18s R: 5′-AGACGACTTCGGTGAGACG-3′

AGPase-F: 5′-GAGAACCCCAACTGGTTTCAG-3′

AGPase-R: 5′-GGTATCAACCTTCATTGCCTT-3′

以18s rRNA作為內(nèi)參，使用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增目的片段和18s rRNA，反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。計(jì)算各基因的△CT，并采用2-△△CT法計(jì)算mRNA轉(zhuǎn)錄倍數(shù)，3次重復(fù)；采用SPSS 19.0 進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的干擾序列克隆

經(jīng)過(guò)比對(duì)，選定的序列是AGPase(登錄號(hào)：KP751443)基因保守區(qū)域300 bp序列；圖1泳道1和2顯示的是經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增出來(lái)的片段條帶，該條帶約為400 bp(含attB接頭)，符合預(yù)期大小，表明擴(kuò)增出了所選的AGPase基因干擾片段。

2.2 AGPase RNAi片段裝入到入門(mén)載體后菌落PCR結(jié)果

將所擴(kuò)增的含有attB接頭的干擾片段與入門(mén)載體pDONR221進(jìn)行BP反應(yīng)，發(fā)生特異性位點(diǎn)重組形成入門(mén)克隆pDONR-AGPase與副產(chǎn)物。圖2為所設(shè)計(jì)引物對(duì)BP反應(yīng)后的菌液PCR結(jié)果，其泳道1、2具有400 bp的清晰條帶，表明入門(mén)載體pDONR-AGPase已構(gòu)建成功。

M：分子量標(biāo)記；1～2：目的序列M: Marker; 1-2: Target sequence圖1 目的基因AGPase干擾片段Fig.1 The interference fragment of target gene AGPase

M：分子量標(biāo)記；1～2：目的序列M: Marker; 1-2: Target sequence圖2 BP反應(yīng)后菌液PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of bacterial solution after BP reaction

2.3 入門(mén)載體pDONR-AGPase與目標(biāo)載體pJawohl8-RNAi進(jìn)行LR反應(yīng)

入門(mén)載體pDONR-AGPase與目標(biāo)載體pJawohl8-RNAi的LR反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌培養(yǎng)，對(duì)菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示擴(kuò)增出了400 bp的條帶(圖3泳道1、2)，與預(yù)期相符，表明經(jīng)過(guò)LR反應(yīng)，干擾序列成功轉(zhuǎn)入到目的載體，形成了所需的干擾表達(dá)載體pJawohl8-RNAi-AGPase。

2.4 干擾表達(dá)載體pJawohl8-RNAi-AGPase酶切結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)干擾載體pJawohl8-RNAi-AGPase成功構(gòu)建，選擇重組質(zhì)粒載體上Acc65I、NheI與SpeI酶切驗(yàn)證。如圖4所示，泳道1為pJawohl8-RNAi目的載體9019 bp；泳道2為pJawohl8-RNAi的NheI與SpeI雙酶切，顯示有約4300與4700 bp 2個(gè)條帶，NheI在質(zhì)粒的8084 bp處，SpeI在質(zhì)粒的3803 bp處，計(jì)算結(jié)果與條帶大小相符合，因其大小太相近，兩條帶接近在一起；泳道3為pJawohl8-RNAi的Acc65I酶切，因該載體沒(méi)有Acc65I酶切位點(diǎn)，所以還是呈現(xiàn)與泳道1大小一樣的條帶；泳道4為構(gòu)建好的pJawohl8-RNAi-AGPase干擾表達(dá)載體，其大小約6540 bp；泳道5為pJawohl8-RNAi-AGPase干擾表達(dá)載體NheI與SpeI雙酶切結(jié)果，考慮到上述NheI與SpeI酶切位點(diǎn)位置，所以應(yīng)具有約4280 bp與2260 bp條帶，泳道5條帶與此相符合；泳道6為pJawohl8-RNAi-AGPase干擾表達(dá)載體Acc65I酶切結(jié)果，應(yīng)具有1026 bp與5514 bp條帶，結(jié)果與預(yù)測(cè)一致；泳道4、5、6的結(jié)果表明了pJawohl8-RNAi-AGPase干擾表達(dá)載體構(gòu)建成功。圖5為最終成功構(gòu)建的pJawohl8-RNAi-AGPase質(zhì)粒圖譜。

M：分子量標(biāo)記；1～2：目的序列M: Marker; 1-2: Target sequence圖3 LR反應(yīng)后菌液PCR結(jié)果Fig.3 PCR results of bacteria solution after LR reaction

M：分子量標(biāo)記；1：目的載體pJawohl8-RNAi；2：目的載體pJawohl8-RNAi的NheI與SpeI雙酶切；3：目的載體pJawohl8-RNAi的Acc65I酶切；4：干擾表達(dá)載體pJawohl8-RNAi-AGPase；5：干擾表達(dá)載體pJawohl8-RNAi-AGPase的NheI與SpeI雙酶切；6：表達(dá)干擾載體pJawohl8-RNAi-AGPase的Acc65I酶切M: Marker; 1: Destination vector pJawohl8-RNAi; 2: Digestion of pJawohl8-RNAi vector by NheI and SpeI enzyme; 3: Digestion of pJawohl8-RNAi vector by Acc65I enzyme; 4: Expression vector pJawohl8-RNAi-AGPase; 5: Digestion of expression vector of pJawohl8-RNAi-AGPase by NheI and SpeI enzyme; 6: Digestion of pJawohl8-RNAi-AGPase vector by Acc65I enzyme圖4 干擾表達(dá)載體pJawohl8-RNAi-AGPase酶切結(jié)果Fig.4 Digestion of interference vector pJawohl8-RNAi-AGPase

圖5 最終構(gòu)建的pJawohl8-RNAi-AGPase質(zhì)粒圖譜Fig.5 Constructed pJawohl8-RNAi-AGPase plasmid map

M：分子量標(biāo)記；A：pJawohl8-RNAi-AGPase干擾質(zhì)粒；AG：轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌的干擾質(zhì)粒M: Marker; A: Interfering plasmid pJawohl8-RNAi-AGPase; AG: Interfering plasmid translated into Agrobacterium圖6 干擾片段的檢測(cè)Fig.6 Detection of interference fragments

2.5 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌PCR鑒定

通過(guò)電擊法將構(gòu)建好的表達(dá)干擾載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101中，經(jīng)過(guò)Kan、Rif、Amp抗性篩選，只有轉(zhuǎn)化菌株才能生長(zhǎng)，進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)；用AGPase干擾片段的引物(AGPase-F，AGPase-R)PCR擴(kuò)增干擾質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌干擾質(zhì)粒，以檢測(cè)所構(gòu)建的pJawohl8-RNAi-AGPase干擾質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌，并獲得陽(yáng)性克隆。圖6所示A為pJawohl8-RNAi-AGPase陽(yáng)性對(duì)照，AG為提取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌質(zhì)粒進(jìn)行PCR，都具有300 bp大小的條帶，與所克隆的干擾片段大小相符合，表明構(gòu)建的干擾質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。

2.6 熒光定量PCR檢測(cè)AGPase基因轉(zhuǎn)錄后抑制

提取轉(zhuǎn)化植株RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以比較轉(zhuǎn)化植株與非轉(zhuǎn)化植株AGPase基因相對(duì)表達(dá)量(圖7)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化含干擾質(zhì)粒菌株的植株AGPase相對(duì)表達(dá)量大幅度降低，為對(duì)照的27.2 %。表明轉(zhuǎn)入的干擾片段對(duì)其轉(zhuǎn)錄的mRNA發(fā)生沉默作用。

3 討 論

本研究前期研究表明蔗糖能促進(jìn)百合小鱗莖膨大發(fā)育，此處蔗糖作為百合生長(zhǎng)利用的碳源具有以下作用：第一，作為合成淀粉的原料；第二，作為信號(hào)因子調(diào)控AGP相關(guān)啟動(dòng)子表達(dá)，從而正調(diào)控AGP，AGP上調(diào)進(jìn)一步提高了淀粉的合成。此外，植物激素在對(duì)AGP調(diào)控中也起到了非常重要的作用。AGPase基因的直接轉(zhuǎn)錄激活子尚未確定，Nagata等[16]從擬南芥cDNA中分離出轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY20，通過(guò)粒子轟擊瞬時(shí)表達(dá)AtWRKY20，可增強(qiáng)ApL3啟動(dòng)子的表達(dá)，啟動(dòng)編碼一個(gè)蔗糖誘導(dǎo)的AGPase大亞基基因。AtWRKY20還激活編碼甘薯AGPase小亞基基因的ibAGP1啟動(dòng)子。在AGPase蛋白結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)一個(gè)橫跨Pro103-Arg115的區(qū)域與AGPase酶底物結(jié)合及變構(gòu)部分移動(dòng)強(qiáng)烈相關(guān)，動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)路徑分析表明激活劑結(jié)合殘基(Lys39)及ATP的主要傳達(dá)通路與Pro103-Arg115殘基環(huán)有關(guān)，分子動(dòng)力學(xué)表明Pro103-Arg115環(huán)在AGPase酶的變構(gòu)反應(yīng)中起著重要的作用，此為一個(gè)只存在于變構(gòu)調(diào)節(jié)的糖核苷酸焦磷酸化酶中的獨(dú)特元件，可能是連接變構(gòu)和催化位點(diǎn)觸發(fā)機(jī)制的一個(gè)關(guān)鍵部分[17]。通過(guò)單點(diǎn)突變研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌AGPase生理負(fù)性和正性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑分別為腺苷-5-單磷酸腺苷(AMP)和果糖-1,6-二磷酸(FBP)，并由此提出了AGPase蛋白酶催化活性調(diào)控模型[18]，并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與活性位點(diǎn)保持信息通路的傳遞變構(gòu)信號(hào)的關(guān)鍵區(qū)域[19]，這對(duì)理解AGPase變構(gòu)調(diào)節(jié)具有重要意義。越來(lái)越多的研究證據(jù)闡述了AGPase的多態(tài)性、調(diào)控信息通路、分子結(jié)構(gòu)變構(gòu)調(diào)節(jié)與功能的關(guān)系等，本研究基于AGP響應(yīng)于植物激素、碳源等因子調(diào)控作用下探索其功能研究的反向遺傳學(xué)方法，為下一步開(kāi)展相關(guān)調(diào)控因子在百合鱗莖發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制研究提供技術(shù)。

O：轉(zhuǎn)化含有空質(zhì)粒農(nóng)桿菌的植株；A：轉(zhuǎn)化含有AGPase干擾質(zhì)粒農(nóng)桿菌的植株O: Transformation of plant containing Agrobacterium; A: Transformation of plant containing Agrobacterium transformed with interfere plasmid圖7 轉(zhuǎn)化植株AGPase基因相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression of AGPase Gene in transformed plants

Pinto等[20]利用RNAi將水稻黃斑病毒復(fù)制酶基因?qū)胨九嘤鼍哂悬S斑病毒抗性的水稻；柴曉杰等[21]采用 RNAi 技術(shù)能有效下調(diào)玉米支鏈淀粉含量。Gateway技術(shù)利用位點(diǎn)特異性重組原理實(shí)現(xiàn)片段定向轉(zhuǎn)移而得到方向正確的重組，其構(gòu)建RNAi載體相對(duì)于傳統(tǒng)的酶切連接構(gòu)建載體有方便、快捷、高效等優(yōu)勢(shì)[22]，只需獲得帶有目的干擾片段的入門(mén)克隆，通過(guò)LR反應(yīng)就可將目的片段轉(zhuǎn)入所需要的表達(dá)載體中，滿足研究不同表達(dá)載體在不同生命體中的表達(dá)特征及目的基因的功能驗(yàn)證。本研究采用兼容Gateway的植物基因沉默雙元載體pJawohl8-RNAi質(zhì)粒帶有280 bp的內(nèi)含子，將干擾序列分別正反向連接在兩邊，可有效表達(dá)dsRNA，形成siRNA實(shí)現(xiàn)基因沉默，所帶有的抗除草劑草銨膦抗性基因，有利于轉(zhuǎn)化后對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的篩選，為研究該基因功能提供了材料與技術(shù)。

4 結(jié) 論

本研究選擇AGPase保守序列作為干擾片段，通過(guò)Gateway技術(shù)成功構(gòu)建pJawohl8-RNAi-AGPase表達(dá)載體，并對(duì)百合愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)出AGPase轉(zhuǎn)錄后表達(dá)量下調(diào)的轉(zhuǎn)化植株。研究百合淀粉合成代謝途徑中AGPase基因的調(diào)節(jié)功能，為該基因功能的進(jìn)一步探究及今后百合組培鱗莖膨大繁育基因調(diào)控技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供了材料與思路。