国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

天山雪蓮sikP基因提高番茄類黃酮含量的研究

2018-08-04 01:34李忠晴王愛英祝建波
西南農(nóng)業(yè)學(xué)報 2018年6期
關(guān)鍵詞:類黃酮雪蓮轉(zhuǎn)基因

張 堯,李忠晴,張 麗,王愛英,祝建波

(石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,新疆 石河子 832003)

【研究意義】對植物類黃酮分子調(diào)控深入研究發(fā)現(xiàn),類黃酮可增強植物的抗逆性、改變花卉的顏色等多方面的作用[1]。通過將單個限制酶基因轉(zhuǎn)入薄荷、大豆和油菜中,對其次生代謝進行調(diào)控,可提高他們的目標(biāo)產(chǎn)物的含量[2-3]。然而,復(fù)雜的植物次生代謝途徑需要大量酶的參與,而不是單個基因所能決定的?!厩叭搜芯窟M展】近年來人們對轉(zhuǎn)錄因子深入研究發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)錄水平上,轉(zhuǎn)錄因子能夠協(xié)同調(diào)控特定代謝途徑的一系列相關(guān)酶的活性,從而提高途徑中相關(guān)基因的表達量,因此轉(zhuǎn)錄因子在多數(shù)性狀調(diào)控途徑中具備很大優(yōu)勢[4]。相關(guān)研究表明,MYB家族基因是高等植物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子,具備許多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征,根據(jù)含MYB-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(R1、R2、R3)數(shù)量的不同,分為R1、R2R3、R1R2R3 3種類型,其中R2R3類型在調(diào)控植物次生代謝過程中起到十分重要的作用。其中玉米P基因是在植物中最早被發(fā)現(xiàn)且功能被驗證的R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子,它通過調(diào)控CHS和DFR基因的表達來促進玉米3-脫氧類黃酮的合成[5]。金治平等人從水母雪蓮愈傷組織中克隆了水母雪蓮MYB轉(zhuǎn)錄因子SmP,對氨基酸進行同源分析發(fā)現(xiàn)SmP基因具有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域典型的特征,存在2個R2R3型MYB結(jié)構(gòu)域[6]。但該基因是否能夠調(diào)控類黃酮合成,并沒有進行進一步深入的研究。新疆地域遼闊,物種資源豐富,其中不乏特色的中藥材,天山雪蓮就是其中一種[7]。天山雪蓮中存在多種藥用成分,比如類黃酮、多糖類物質(zhì)和生物堿等[8-9],其中類黃酮是新疆天山雪蓮最主要的藥用成分[10]。據(jù)研究表明天山雪蓮總黃酮的抗氧化活性高于水母雪蓮和雪兔子[11]?!颈狙芯壳腥朦c】本文將天山雪蓮R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子sikP基因的表達載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化番茄,并通過分子手段進行鑒定獲得轉(zhuǎn)基因番茄?!緮M解決的關(guān)鍵問題】對其類黃酮含量進行初步檢測,已達到對其功能進行驗證的目的。

1 材料與方法

1.1 供試材料

番茄(亞心87-5)保存于新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室。農(nóng)桿菌(GV3101)、植物過表達載體pBI121-sikP來自于新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室Taq酶、RNA反轉(zhuǎn)錄酶、Trizol提取液、植物激素和抗生素等均來自大連寶生物生物工程有限公司;配制MS培養(yǎng)基的各種試劑盒其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化番茄 首先在無菌超凈工作臺中將番茄種子放入10 %次氯酸鈉中浸泡10 min,期間不間斷的搖晃,再用無菌水進行5次沖洗,再將番茄種子傾倒無菌濾紙上進行水分吸干,均勻接種到1/2MS培養(yǎng)基上,用封口膜密封后進行3 d黑暗條件培養(yǎng),待番茄種子露白后進行正常的光照培養(yǎng),1周后,切取番茄下胚軸作為外植體放置在培養(yǎng)基(MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IAA)上暗培養(yǎng)2 d后,將攜帶有PBI121-sikP載體的農(nóng)桿菌侵染預(yù)培養(yǎng)2 d的番茄下胚軸[10-11],侵染時間為10~15 min。將侵染過的下胚軸轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基( MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IAA+100 mg/L Kan+400 mg/L Cef)上培養(yǎng),每14 d換1次培養(yǎng)基。定期進行觀察待分化出的小芽長至2~3 cm后,將其切下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2 MS+0.5 mg/L IAA+100 mg/L Kan+400 mg/L Cef)中繼續(xù)進行抗性篩選,最終獲得抗性苗。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因番茄的PCR和RT-PCR鑒定 首先提取抗性番茄苗DNA,并以未轉(zhuǎn)化的番茄作為對照進行PCR擴增[12]。然后提取PCR陽性的番茄植株的RNA[13],同樣以未轉(zhuǎn)化的番茄作為對照在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行cDNA 的合成,再進行PCR的擴增。將通過篩選和鑒定的陽性番茄植株移栽至深18 cm、直徑20 cm的花盆中,在培養(yǎng)室正常條件下生長。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因番茄總黃酮含量的測定[14]①樣品溶液的制備。待測樣品采用超聲波法進行樣品溶液的制備,精確稱取3 g番茄葉片,將其放入錐形瓶中,加入55 mL 95 %的乙醇,將其放入水溫為50 ℃的超聲波清洗器進行20 min處理后,將其轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)進行濃縮處理至5 mL即為番茄樣品溶液。②對照品溶液的制備。精確稱取20 mg對照品蘆丁放入100 mL的容量瓶內(nèi),加入70 %的乙醇進行溶解后定容至0.2 g/L,作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。③最大吸收波長的確定。取適量的樣品溶液,加入5 %亞硝酸鈉溶液,通過硝酸鋁進行顯色,再進行420~700 nm波長掃描,最終進行最大吸收波長的確定。④標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。取對照品蘆丁儲備溶液通過70 %的乙醇稀釋成0、0.020、0.040、0.060、0.080、0.100、0.120、0.140 g/L的溶液后,在每個稀釋液中分別取1 mL注入試管內(nèi),在每個試管中加入1 mL的70 %的乙醇,再向每個試管中加入5 %的NaNO2溶液0.5 mL后進行混勻并靜置6 min,再向各試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 %的Al(NO3)3溶液0.5 mL,混勻后在靜置6 min,再次向各試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的NaOH溶液2 mL,混用后靜置15 min。最后通過紫外分光光度器進行510 nm波長吸光值的測定,每個樣品3次重復(fù)。⑤番茄樣品溶液總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定。將1 mL樣品溶液放入試管內(nèi),加入φ=70 %的乙醇1 mL及0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5﹪的 NaNO2溶液,混勻,6 min后加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的 Al(NO3)3溶液,混勻后在靜置6 min,再次向各試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的NaOH溶液2 mL,混用后靜置15 min。最后通過紫外分光光度器進行510 nm波長吸光值的測定,每個樣品3次重復(fù)。計算番茄葉片類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

計算公式:x=[C×V1×V2/V3]×100 %/m,式中,x為樣品中類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù);C為通過回歸方程計算的樣品溶液質(zhì)量濃度,(g/L);V1為樣液體積,mL;V2為樣品定容體積,mL;V3為通過顯色反應(yīng)測定的樣品溶液的體積,mL;m為樣品量,mg[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得及分子鑒定

利用含有pBI121-sikP的農(nóng)桿菌GV3101浸染番茄下胚軸15~20 d后,下胚軸兩端傷口處能分化出淡黃色愈傷(圖1A、B),繼續(xù)培養(yǎng)能長出綠色芽點,并再生出小芽( 圖1C)。將小芽切下轉(zhuǎn)到1/2MS生根培養(yǎng)基上,20~30 d 后長出較發(fā)達的根系( 圖1D),對無菌苗進行PCR(圖2)和RT-PCR( 圖3)檢測,說明sikP基因已整合到番茄體內(nèi)并能夠轉(zhuǎn)錄。將鑒定為陽性的無菌苗移栽至深18 cm、直徑20 cm的花盆中,在培養(yǎng)室中生長(圖4)作為實驗材料。

A:番茄下胚軸;B:抗性芽的再生;C:再生芽生根;D:再生植株的移栽圖1 轉(zhuǎn)基因番茄再生及抗性植株篩選Fig.1 Regeneration of transgenic tomato and selection of resistant plantlet

2.2 轉(zhuǎn)基因番茄和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將稀釋不同濃度的蘆丁溶液通過紫外分光光度器進行510 nm波長吸光值的測定,以蘆丁的不同濃度作為橫坐標(biāo),以檢測的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值A(chǔ)作為縱坐標(biāo)進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。求得回歸方程為:C=115.72OD510+ 0.0938,相關(guān)系數(shù)R2= 0.9959,其中,C為黃酮的濃度,單位為g/L(圖5)。結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系。

M: DNA marker Ⅲ;1:陽性對照;2:陰性對照;3~7:轉(zhuǎn)基因番茄圖2 轉(zhuǎn)基因番茄sikP基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR results of sikP in transgenic tomato

M: DNA marker Ⅲ;1~5:轉(zhuǎn)基因番茄;6:陰性對照;7:陽性對照圖3 轉(zhuǎn)基因番茄sikP基因RT-PCR擴增Fig.3 RT-PCR results of sikP in transgenic tomato

圖4 轉(zhuǎn)sikP基因番茄Fig.4 Transgenic tomato of sikP gene

2.2.2 最大吸收波長的測定 取適量的樣品溶液,加入5 %亞硝酸鈉溶液,通過硝酸鋁進行顯色,再進行420~700 nm波長掃描,最終進行最大吸收波長的確定。番茄樣品溶液通過通過硝酸鋁進行顯色后再進行420~700 nm波長掃描,結(jié)果顯示在510 nm波長時吸光值最大,為此選擇510 nm波長進行后續(xù)吸光度值的測定。

2.2.3 番茄總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 對轉(zhuǎn)基因番茄和對照組番茄的樣品提取液經(jīng)過顯色反應(yīng)后,通過紫外分光光度器進行510 nm波長吸光值的測定,結(jié)果表明:和對照組相比轉(zhuǎn)基因番茄總黃酮質(zhì)量分析明顯提高,轉(zhuǎn)基因組是對照組的5.4倍(表1)。

3 討 論

一般來說轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子通過調(diào)控次生代謝來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育,通過在類黃酮代謝途徑的研究發(fā)現(xiàn),擬南芥、矮牽牛、玉米和水稻等植物中具有多個調(diào)控活性的轉(zhuǎn)錄因子[15]。目前根據(jù)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特點進行轉(zhuǎn)錄因子的分類,分為7大家族:b-HLH( Basic-helix-loop-helix)家族、WRKY家族、MYB家族、WD40家族、homeodomain家族、WIP家族和 bMADS家族[16-18],與類黃酮代謝相關(guān)的主要是MYB家族、bHLH家族和WD40家族的轉(zhuǎn)錄因子。這3種轉(zhuǎn)錄因子一般是相互作用的,它們通過形成MYB-bHLH-WD40復(fù)合體的形式來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達來調(diào)控類黃酮代謝通路。比如MYB家族轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié) WD40和 bHLH的表達來調(diào)控調(diào)控類黃酮代謝通路。但是某些MYB轉(zhuǎn)錄因子通過單獨調(diào)節(jié)類黃酮代謝通路上的節(jié)點基因的表達來促進類黃酮的合成[19-24]。與類黃酮合成相關(guān)的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子最早被發(fā)現(xiàn)的植物是玉米,玉米P基因是MYB家族轉(zhuǎn)錄因子,該基因通過在墨西哥甜玉米中的過表達試驗,表明P基因通過調(diào)節(jié)CHS和DFR基因的表達來調(diào)控類黃酮的合成[25-27]。截止到目前,人們從植物中已經(jīng)克隆了100多個MYB家族轉(zhuǎn)錄因子,并進行了功能的分析。結(jié)果顯示,與類黃酮合成相關(guān)的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子蛋白并不都是轉(zhuǎn)錄激活因子,也存在負(fù)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子從而抑制相關(guān)基因的表達。例如,人們在擬南芥中克隆的R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白AtMYBL2和R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子AtMYB60,可有效的促進花青素的合成[28-30]。而在銀杏中克隆的MYB轉(zhuǎn)錄因子GbMYBF2,對其進行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化和功能分析發(fā)現(xiàn)該類是負(fù)調(diào)控類黃酮的合成[31]。

圖5 類黃酮測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of flavonoids determination

圖6 天山雪蓮類黃酮提取液紫外掃描圖Fig.6 Scanning curve of extractive from Sasussured involucrata by U.V

樣品Samples吸光度OD510質(zhì)量濃度(g/L)Conter.of flaonoids質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)Contentof flaonoids質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值(%)MeanCK(對照)0.0170.0390.0282.06104.60673.33400.00340.00770.00560.0056sikP(轉(zhuǎn)基因)0.1310.1950.14415.253122.659216.75750.02540.03780.02790.0304

本文所研究的sikP基因?qū)儆赗2R3亞家族的MYB轉(zhuǎn)錄因子,和水母雪蓮SmP基因結(jié)構(gòu)類似,那么sikP基因是否具有調(diào)控類黃酮次生代謝途徑的作用呢。是轉(zhuǎn)錄激活因子還是負(fù)調(diào)控類黃酮的合成呢。因此,通過對天山雪蓮sikP基因的植物過表達載體pBI121-sikP,經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo),遺傳轉(zhuǎn)化番茄,再采用分子手段進行鑒定,獲得轉(zhuǎn)基因番茄,最后對其類黃酮含量進行初步檢測。結(jié)果顯示,與對照組番茄相比轉(zhuǎn)基因番茄類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高,轉(zhuǎn)基因番茄類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)是對照組番茄的5.4倍,這將為以后對實現(xiàn)天山雪蓮類黃酮物質(zhì)人工合成研究奠定基礎(chǔ),是解決天山雪蓮資源匱乏的有效方法之一。

猜你喜歡
類黃酮雪蓮轉(zhuǎn)基因
探秘轉(zhuǎn)基因
轉(zhuǎn)基因,你吃了嗎?
食物五顏六色,預(yù)防認(rèn)知下降
常吃柑橘 腦卒中降三成
為什么雪蓮不怕嚴(yán)寒
攝入類黃酮有助預(yù)防癌癥和心臟病
綠茶類黃酮生物活性研究進展
天然的轉(zhuǎn)基因天然的轉(zhuǎn)基因“工程師”及其對轉(zhuǎn)基因食品的意蘊
玩轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因
怕打針