張璐

【摘要】目的：對(duì)穩(wěn)定門冬胰島素結(jié)晶制備方法進(jìn)行研究，并對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高門冬胰島素的穩(wěn)定性。方法：在室溫條件下經(jīng)過有機(jī)酸對(duì)比，對(duì)于其他胰島素結(jié)晶與有機(jī)溶劑中必須添加物質(zhì)的選擇等方式，經(jīng)過對(duì)比實(shí)驗(yàn)與優(yōu)化要求晶型具有穩(wěn)定均一性。結(jié)果：根據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果表明，有機(jī)酸適宜采用濃度為0.5M-1.5M之間的甘氨酸，乙腈、苯酚及氯化鈉溶液采取體積分?jǐn)?shù)12%-18%、0.2%-0.3%、0.2M-0.3M，同時(shí)還包括含量為門冬胰島素制備液蛋白濃度稀釋至2.0-5.0g·L^-1重組門冬胰島素。在條件為pH在6.0-6.5環(huán)境下加入醋酸鋅組成的結(jié)晶液，經(jīng)過放大驗(yàn)證能夠得到的晶體為單斜針狀，晶體的形狀規(guī)則且均一，并且具有較高的結(jié)晶收率。結(jié)論：與不使用結(jié)晶工藝相比，直接調(diào)成凍干后收集產(chǎn)品不僅能夠顯著地提高收率，也能有效地減少凍干時(shí)間。因此門冬胰島素原料藥的結(jié)晶方法具有良好的結(jié)晶收率，能夠顯著地降低原料藥的生產(chǎn)損失，適合于工業(yè)化的大量生產(chǎn)。

【關(guān)鍵詞】穩(wěn)定；門冬胰島素；結(jié)晶；制備方法

門冬胰島素屬于蛋白類生物大分子，由于其為生物大分子，因此在體外難以保持其獨(dú)有的完整生物活性，因此在研究中該如何保持此類分子的基本完整的生物活性，一直以來是相關(guān)人員的研究重點(diǎn)工作。晶體結(jié)構(gòu)的存在對(duì)于生物大分子是處于較為穩(wěn)定的狀況，與其他小分子物質(zhì)相同，蛋白質(zhì)晶體是按分子單元一定的排列順序堆積而成的，因而便能形成一個(gè)較為獨(dú)特的空間點(diǎn)群，其在外觀的表現(xiàn)上主要為其具有不同規(guī)則的集合行政固體，蛋白質(zhì)晶體與無定形態(tài)相比具有較高而定生物活性與理化穩(wěn)定性。生物蛋白類藥物大分子的存在形式為晶體，給藥方式為晶體，此種給藥方式能夠顯著地提高藥物的穩(wěn)定性，同時(shí)也能夠提高藥物的有效成分濃度，因而在臨床應(yīng)用中具有可控性釋放等優(yōu)點(diǎn)。血糖類藥物中胰島素及其類似物作為其中有效且重要的藥物，從未間斷對(duì)其結(jié)晶的研究。但目前由于尚未得到理想的質(zhì)量?jī)?yōu)異胰島素及其類似物晶體的生產(chǎn)工藝，因此現(xiàn)階段我國(guó)胰島素及其類似物所面臨的主要問題仍然為如何進(jìn)一步對(duì)結(jié)晶技術(shù)與條件進(jìn)行優(yōu)化。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

門冬胰島素，主要試劑包括甘氨酸、乙酸鋅、水飽和酚、乙酸、氯化鈉、氫氧化銨、鹽酸、乙腈；其余試劑至少為分析純。主要儀器包括電子天平、微孔溶液過濾器、PH計(jì)、光學(xué)顯微鏡、超高效液相色譜儀。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1有機(jī)酸體系

備制3批劑量為30ml的結(jié)晶體系，乙酸含量分別為0.5M、1.0M及1.5M，將門冬胰島素制備液蛋白濃度稀釋至2.5goL^-4，苯酚：體積分?jǐn)?shù)含量為0.2%，將pH用氨水將其調(diào)至pH6.0，加入劑量為200mgoLq的乙酸鋅，在恒溫20-24℃的環(huán)境中將其進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)10h的攪拌，并將溫度調(diào)到2-8℃左右，并停止對(duì)結(jié)晶的攪拌。而在第2個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中，將乙酸改為檸檬酸，在第3個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中，則將乙酸改為甘氨酸。對(duì)晶型效果的觀察采用顯微鏡圖片進(jìn)行分析，旨在對(duì)合適濃度的有機(jī)酸進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2有機(jī)溶劑

通常情況下，有機(jī)溶劑在精純之后得到的門冬胰島素其本身便具有一定的乙腈含量，為了能夠盡可能地減少給原料帶入不同的雜質(zhì)，因此在實(shí)驗(yàn)的過程中對(duì)于有機(jī)溶劑可以選擇乙腈。在第4個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在對(duì)有機(jī)酸體系進(jìn)行篩選的過程中，分別加入體積含數(shù)分別為10%、15%以及20%的乙腈。對(duì)晶型效果的觀察采用顯微鏡圖片進(jìn)行分析，旨在對(duì)合適濃度的乙腈進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3鹽

在對(duì)鹽進(jìn)行選擇的過程中，可以通過結(jié)晶液中鹽的過飽和度來進(jìn)一步推進(jìn)結(jié)晶形成。第5個(gè)實(shí)驗(yàn)室在已經(jīng)篩選的體系下分別加入含量為0.1M、0.2M以及0.3M的氯化鈉。對(duì)晶型效果的觀察采用顯微鏡圖片進(jìn)行分析，旨在對(duì)合適濃度的氯化鈉進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4pH

根據(jù)相關(guān)的研究資料表明，在門冬胰島素等電點(diǎn)附近其具有最低的溶解度，在是實(shí)際實(shí)驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)，在其中加入一定量的醋酸鋅后在一定程度上升高pH值。試驗(yàn)結(jié)果表明，在對(duì)pH進(jìn)行調(diào)節(jié)的過程中最好的方式是在加入鋅離子前操作，因此，在加入并混勻除鋅離子之外的各物質(zhì)后，再對(duì)pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，然后在此基礎(chǔ)上加入醋酸鋅。第6個(gè)實(shí)驗(yàn)則表明在已經(jīng)篩選出的體系基礎(chǔ)上，分別選取4.5、6.0以及7.5pH。對(duì)顯微鏡圖片進(jìn)行分析并比較結(jié)晶收率來對(duì)合適的pH進(jìn)行篩選。

2結(jié)果

在前3個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中表明，有機(jī)酸在濃度為0.5M-1.5M之間時(shí)，其種類能夠?qū)﹂T冬胰島素結(jié)晶造成較大影響。在選擇濃度為1.0M甘氨酸體系中，分別加入體積分?jǐn)?shù)含量為10%、15%及20%的乙腈具有非常好的結(jié)晶，且晶體形狀規(guī)則。在已經(jīng)篩選的體系下分別加入含量為0.1M、0.2M以及0.3M的氯化鈉中，在放大64倍的條件下晶體形狀仍然規(guī)則，其中3a結(jié)晶的顆粒型晶體較多，但3c的結(jié)晶具有長(zhǎng)短不一的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)pH能夠在很大程度上對(duì)結(jié)晶造成影響，在放大64倍的條件下晶體形狀仍然規(guī)則，其中4a結(jié)晶的顆粒較為細(xì)小，但4c的結(jié)晶具有長(zhǎng)短及寬度不一的特點(diǎn)。

3討論

門冬胰島素屬于一種速效的胰島素類似物，具體方式是通過重組DNA技術(shù)替換人胰島素B鏈第28位Pru，使其成為Asp，此種方式改變了氨基酸，同時(shí)也對(duì)胰島素單體分子造成破壞，從而使其難以形成二聚體，也在一定程度上降低了分子間的聚合力。所以對(duì)人胰島素相比，門冬胰島素相更加容易形成一個(gè)單體，此種方式能夠?qū)ζは挛账俾蔬M(jìn)行加速，也相對(duì)地縮短了起效時(shí)間與持續(xù)時(shí)間。門冬胰島素與可溶性的人胰島素比較而言，門冬胰島素的藥代動(dòng)力學(xué)特性占常規(guī)人胰島素的1/2左右，起效的時(shí)間在10-20分鐘之間，達(dá)峰在30-40分鐘之間，持續(xù)作用的時(shí)間在3-6小時(shí)。由于其皮下吸收的速度更快，因而便能夠顯著地對(duì)餐后血糖進(jìn)行控制，同時(shí)由于其作用時(shí)間不長(zhǎng)，因而便能有效地降低患者低血糖風(fēng)險(xiǎn)。近年來，隨著市面上胰島素的類似物種類越來越豐富，也隨之加快了胰島素類似物結(jié)晶的發(fā)展，且蛋白晶體能夠?qū)Φ鞍追€(wěn)定性起到很好的維持作用。在臨床上對(duì)血糖類藥物進(jìn)行有效控制中，胰島素及其類似物作為其重要的手段，對(duì)于其結(jié)晶的研究從未間斷。氯化鋅與乙酸鋅在甘氨酸體系中的引入均會(huì)在一定程度上降低pH，根據(jù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，調(diào)節(jié)pH的最好方式是在加入鋅離子前進(jìn)行操作。主要原因在于通常情況下，我們認(rèn)為加入鋅離子便意味著結(jié)晶的開始，若在加入鋅離子后再對(duì)pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，則會(huì)對(duì)晶體成核形態(tài)造成影響，最終會(huì)對(duì)晶體的均一性造成影響。因此，這就要求在除鋅離子以外的各類物質(zhì)加完并混勻后，再將pH調(diào)節(jié)為6.0-6.5之間，并在此基礎(chǔ)上加入鋅離子，此時(shí)pH便會(huì)降至5.5-6.0左右。由于此項(xiàng)操作能夠在很大程度上減少結(jié)晶過程中的動(dòng)力干擾，因而便能夠使晶體的形成更加均一。除此之外，在實(shí)驗(yàn)中對(duì)于結(jié)晶液中的鋅的加入形式通常為鋅鹽，其用量按照鋅離子與胰島素摩爾比，可以得出乙酸鋅與氯化鋅均為其代表性的鋅鹽，本次試驗(yàn)中考慮到結(jié)晶的工藝，因而選擇乙酸鋅作為鋅的代表。通過本次試驗(yàn)顯示，有機(jī)酸適宜采用濃度為0.5M-1.5M之間的甘氨酸，乙腈、苯酚及氯化鈉溶液采取體積分?jǐn)?shù)12%-18%、0.2%-0.3%、0.2M-0.3M，同時(shí)還包括含量為門冬胰島素制備液蛋白濃度稀釋至2.0-5.0g·L-1重組門冬胰島素。在條件為pH在6.0-6.5環(huán)境下加入醋酸鋅組成的結(jié)晶液，經(jīng)過放大驗(yàn)證能夠得到的晶體為單斜針狀，晶體的形狀規(guī)則且均一，并且具有較高的結(jié)晶收率。除此之外，此種方式具有較高的生產(chǎn)效率與較短的凍干時(shí)間，因此在原料藥的生產(chǎn)的過程中能有效減少其損失，最終提高其產(chǎn)品收率。結(jié)果表明，與不使用結(jié)晶工藝相比，直接調(diào)成凍干后收集產(chǎn)品不僅能夠顯著地提高收率，也能有效地減少凍干時(shí)間。除此之外，開發(fā)門冬胰島素結(jié)晶工藝能夠顯著地降低胰島素產(chǎn)品生產(chǎn)成本，在市場(chǎng)上有效地提高國(guó)產(chǎn)胰島素競(jìng)爭(zhēng)力。

綜上所述，門冬胰島素原料藥的結(jié)晶方法具有良好的結(jié)晶收率，能有效地減少原料藥生產(chǎn)損失，提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。