腦卒中后抑郁是腦卒中常見的并發(fā)癥之一，指腦卒中后除了出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀外，同時(shí)出現(xiàn)的情緒低落、語言減少、睡眠障礙、無興趣、悲觀、能力下降及食欲下降，胸悶、頭暈等軀體不適。目前已有大量報(bào)道表明抑郁和焦慮等負(fù)面心理狀態(tài)會導(dǎo)致營養(yǎng)狀況下降，免疫功能降低和治療依從性降低，導(dǎo)致治療效果不佳。腦神經(jīng)營養(yǎng)因子3(Neurotrophic factor-3，NT-3)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，增加突觸可塑性，調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)。NT-3在神經(jīng)細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化及功能維持中發(fā)揮著重要作用。NT-3可促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)及再生，可減輕腦及脊髓受損后的繼發(fā)壞死。NT-3在神經(jīng)損傷修復(fù)過程中起重要作用。有研究表明抑郁癥的發(fā)生與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(braind erivedneurotrophicfactor，BDNF)和NT-3等神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrphic factor NTF)的分泌異常有關(guān)。有研究報(bào)道小腦的功能不但與平衡有關(guān)，還可能與情緒及認(rèn)知過程相關(guān)。而腦卒中后抑郁是小腦潛在情緒特征表現(xiàn)紊亂的結(jié)果。但NT-3在腦卒中后抑郁大鼠小腦中的變化尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究腦卒中后抑郁大鼠模型中小腦NT-3及Trk-C的表達(dá)變化，探討PSD的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康成年SD大鼠52只[動(dòng)物質(zhì)量合格證：SYXK(滇) 2005-0004]，體質(zhì)量：(250±50) g，清潔級。對本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的所有處置均符合大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。試劑：Trizol試劑盒，NT-3、Trk-C、GADPH引物(購于大連寶生物工程公司)，RT-PCR試劑盒(購于Fermentas公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 專業(yè)技術(shù)人員對SD大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分(Open-field法)。根據(jù)評分結(jié)果將得分相近的SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、卒中組、抑郁組和PSD組，每組13只大鼠。正常組：不給予其他刺激正常飼養(yǎng)。卒中組：采用線栓法制備腦缺血模型。抑郁組：每籠1只單獨(dú)隔離飼養(yǎng)。給以慢性不可預(yù)見的中等應(yīng)激刺激(CUMS)制備慢性應(yīng)激抑郁模型。PSD組：采用線栓法制備腦缺血模型后每籠1只飼養(yǎng)，術(shù)后1 w CUMS制備PSD模型。以上各組通過蔗糖水試驗(yàn)、Longa5分法及水平木棒試驗(yàn)證實(shí)各種均造模成功。各組大鼠術(shù)后均腹腔注射青霉素抗感染。每組SD大鼠均在隔離的環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 造模成功后29 d，每組取5只大鼠用生理鹽水從左心室灌洗后，灌注4%的多聚甲醛后，充分暴露大鼠腦組織，切取小腦組織(冠狀位)，并置于20%的蔗糖溶液中，浸泡48 h至組織沉底。然后用石蠟將組織包埋，于石蠟切片機(jī)上連續(xù)切片(10 μm)。將各組大鼠石蠟切片標(biāo)本脫蠟后行免疫組化二步法染色，一抗為NT-3和Trk-C兔抗單克隆抗體(EPOT MICS)，腦片中加入一抗后置于4 ℃冰箱過夜，次日加入PV-9000試劑盒中的試劑1(北京中杉)在37 ℃溫箱孵育30 min，漂洗后加入PV-9000試劑盒中的試劑2(羊抗兔)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PDS代替一抗作為陰性對照。每只大鼠選不連續(xù)的5張切片，用Motic BA300顯微鏡進(jìn)行攝片。每張切片拍攝5個(gè)視野，倍數(shù)為400×，記錄小腦陽性細(xì)胞數(shù)(雙盲法)。

1.2.3 小腦組織NT-3及Trk-C mRNA 表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。造模后29 d各組取8只大鼠均在3.6%水合氯醛腹腔麻醉后開顱取腦，冠狀面取0.5 cm厚約100 mg小腦組織。用4℃預(yù)冷的DEPC水沖洗標(biāo)本3次，將標(biāo)本置EP管中，保存于-80 ℃冰箱中。采用Trizol試劑盒提取總RNA，在紫外分光光度儀中檢測其濃度和純度，A260/A280值為1.8～2.0。合成cDNA，起始總RNA樣品均取4 μg。用合成的cDNA第一鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。GenBank 里查找NT-3、Trk-C與內(nèi)參GADPHDE mRNA序列：NT-3上游5’-AAAGGAGTTTGCCAGAAGA-3’，下游5’- TGTCAATGGCTGAGGACTT-3’，長度438bp;Trk-C 上游5’- CAACAAGCCCACCCACTA-3’，下游5’-GCCACAGGACCCTTCATTC-3’，長度312bp;GADPHDE 上游5’-CCGTATCGGACGCCTGGTTA-3’，下游5’-CAGTGATGGATGGACTGTGGT-3’，長度512 bp。采用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物(大連寶生生物工程公司制備)。PCR反應(yīng)：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 1 min，退火55 ℃1 min，延伸72 ℃ 1 min共35個(gè)循環(huán)，總延伸72 ℃ 10 min。擴(kuò)增NT-3、Trk-C與內(nèi)參GADPHDE。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用BIO-GEL凝膠成像儀拍攝凝膠圖片，使用ImageJ圖像分析軟件測定目的基因條帶灰度值，作為NT-3、Trk-C mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化 各組大鼠小腦表達(dá)NT-3和Trk-C陽性細(xì)胞呈棕黃色.(見圖1)。免疫組化結(jié)果顯示，PSD組小腦NT-3免疫陽性細(xì)胞數(shù)較正常對照組明顯減少(P<0.05)，其余各組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PSD組及抑郁組大鼠小腦Trk-C免疫陽性細(xì)胞數(shù)均較正常對照組及腦卒中明顯減少(P<0.05);其余各組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表 1)。

①正常組NT-3陽性細(xì)胞的表達(dá);②卒中組NT-3陽性細(xì)胞的表達(dá);③抑郁組NT-3陽性細(xì)胞的表達(dá);④PSD組NT-3陽性細(xì)胞的表達(dá);⑤正常組Trk-C陽性細(xì)胞的表達(dá);⑥卒中組Trk-C陽性細(xì)胞的表達(dá);⑦抑郁組Trk-C陽性細(xì)胞的表達(dá);⑧PSD組Trk-C陽性細(xì)胞的表達(dá)

表1 各組大鼠小腦NT-3及Trk-C免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)比較(個(gè)/視野，

注：與正常對照組比較，*P<0.05;與卒中組比較，▲P<0.05

2.2 各組大鼠小腦NT-3及其高親和力受體Trk-C mRNA的表達(dá)變化 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組大鼠小腦組織中均有GADPH、NT-3及Trk-C mRNA的表達(dá)(見圖2)。

PSD組NT-3 mRNA表達(dá)低于正常組(P<0.05)，其余各組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠小腦皮質(zhì)Trk-C mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

1：Marker DL2000;2～5：分別示正常對照組、卒中組、抑郁組和PSD組的電泳條帶。左邊標(biāo)示不同因子，右邊標(biāo)示各因子的分子量

圖2 各組大鼠小腦皮質(zhì) 內(nèi)參GADPH、NT-3和Trk-C的的PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 各組大鼠小腦NT-3及Trk-C mRNA表達(dá)比較(相對光密度值，

注：與正常對照組比較，*P<0.05

3 討 論

PSD是腦卒中患者的常見并發(fā)癥，是指發(fā)生于腦卒中后的一種繼發(fā)性抑郁癥，發(fā)病率可達(dá)31.67%～46.0%[2，3]。PSD與腦卒中患者預(yù)后密切相關(guān)。通過對PSD的機(jī)制研究來減少卒中后抑郁的發(fā)生率，降低腦卒中患者的致殘率、死亡率。而PSD 發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前存在神經(jīng)解剖、遞質(zhì)、內(nèi)分泌、炎性、社會心理等多種學(xué)說，但以大腦受損及受損部位為基礎(chǔ)的生物學(xué)機(jī)制占主要優(yōu)勢。大量研究發(fā)現(xiàn)PSD的發(fā)生與大腦受損部位密切相關(guān)[4，5]。而邊緣系統(tǒng)-皮層-紋狀體-蒼白球-丘腦神經(jīng)環(huán)路(limbic-cortical-striatal-pallidal-thalamic，LCSPT)受損可能會導(dǎo)致抑郁的發(fā)生得到國內(nèi)外學(xué)者的肯定[6]。小腦一直以來均認(rèn)為與大腦運(yùn)動(dòng)及平衡密切相關(guān)。但有研究表明小腦可能參與人類認(rèn)知、自主和情感等功能活動(dòng)。這主要可能是因?yàn)樾∧X與大腦皮質(zhì)間可能存在著大量的纖維聯(lián)系(“大腦皮質(zhì)-腦橋-小腦”投射及“小腦-丘腦-紋狀體-大腦皮質(zhì)”投射)[7]，而大腦皮質(zhì)受損可導(dǎo)致認(rèn)知功能的下降。Schmahmann等也報(bào)道了抑郁、精神分裂癥等精神紊亂均與小腦病變密切相關(guān)[8]。小腦損傷導(dǎo)致抑郁的機(jī)制可能通過浦肯野纖維引起，PSD大鼠小腦組織發(fā)現(xiàn)浦肯野纖維細(xì)胞數(shù)目減少。郭旭等通過對小腦卒中患者的臨床分析證實(shí)小腦參與高級認(rèn)知功能[9]?？敌Φ纫舶l(fā)現(xiàn)小腦頂核通過小腦-下丘腦通路調(diào)控炎性因子參與PSD的發(fā)生[10]。

神經(jīng)營養(yǎng)因子家族是人體內(nèi)重要的生長因子，具有促進(jìn)神經(jīng)元生長和神經(jīng)營養(yǎng)作用，參與神經(jīng)元的發(fā)育、生長和凋亡特性的表達(dá)[11，12]。NT-3是該家族中的重要一員，NT-3是由119個(gè)氨基酸組成的15 kd堿性蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)里主要分布在小腦、海馬、脊髓、腦干等部位[13]。NT-3作用廣泛，對各級神經(jīng)元及體內(nèi)感覺、運(yùn)動(dòng)、交感神經(jīng)元等均有作用，對顱內(nèi)各種損傷及抑郁均有作用[14，15]。而其特異性受體為原肌球蛋白的相關(guān)激酶C(Trk-C)，被NT-3激活的Trk-C受體可以募集細(xì)胞漿內(nèi)的信號蛋白將信號傳遞到胞內(nèi)，參與顱內(nèi)神經(jīng)元的生存及發(fā)育過程，促進(jìn)神經(jīng)元再生，調(diào)節(jié)神經(jīng)元修復(fù)等多條途徑[16]。NT-3對腦損傷后神經(jīng)修復(fù)有刺激作用[17]，但與其他腦神經(jīng)營養(yǎng)因子不同，NT-3在腦損傷后表達(dá)減少[18]，這與本研究結(jié)果相符合。而何國琪等發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可降低大鼠腦內(nèi)NT-3的表達(dá)[19]，慢性應(yīng)激后大鼠NT-3下調(diào)促進(jìn)了神經(jīng)元凋亡。有研究顯示生理?xiàng)l件的成年神經(jīng)元再生反應(yīng)被抑制可能與抑郁癥的發(fā)生及癥狀相關(guān)，而治療抑郁癥的藥物大多與神經(jīng)再生具有一定的調(diào)節(jié)作用[20]。不同作用途徑的抗抑郁藥均可引起神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NT-3及其功能性受體Trk-B、Trk-C轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平的改變，在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展及治療過程中在發(fā)揮著重要作用。本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)BDNF在PSD的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[21，22]。目前，國內(nèi)外關(guān)于NT-3在PSD方面作用機(jī)制主要集中在額葉、海馬及大腦皮質(zhì)等部位的研究上。PSD患者損傷部位主要在左側(cè)半球、額顳葉及基底節(jié)[23]。而NT-3及Trk-C在PSD大鼠小腦的表達(dá)情況至今未見報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各組大鼠小腦中均有NT3和Trk-C免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)。各組相比較發(fā)現(xiàn) PSD組NT-3免疫陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)較正常組明顯減少;NT-3 mRNA在各組也均有表達(dá)，其中PSD組表達(dá)量最少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PSD組NT-3免疫陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)減少提示NT-3在PSD的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用。抑郁組及PSD組大鼠小腦Trk-C免疫陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)較正常組及卒中組明顯減少(P<0.05);PSD組大鼠小腦Trk-C mRNA表達(dá)較正常組也有所減少，其余各組表達(dá)中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NT-3與Trk-C表達(dá)不完全一致原因可能是多方面的。NT-3不僅通過Trk-C來表達(dá)，Trk-A、Trk-B也可以和NT-3結(jié)合。NT-3主要通過p75和Trk- C兩種受體起作用，p75是NT-3的低親和力受體，Trk-C為高親和力受體。本實(shí)驗(yàn)NT-3 mRNA與Trk-CmRNA的檢測不一致原因還可能與其分泌機(jī)制有關(guān)，同時(shí)也提示了僅從基因水平尚不能完全顯示PSD大鼠小腦皮質(zhì)NT-3和Trk-C的最終表達(dá)情況。NT-3與Trk-C結(jié)合后，刺激受體自身磷酸化，激活Ras[24]，通過P13K和/或AKt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及MEK和/或MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用[25]。NT-3與Trk-C表達(dá)涉及多方面因素，因此蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)可能并不一致。

本實(shí)驗(yàn)仍有很多不足之處需進(jìn)一步改進(jìn)，后續(xù)需增大樣本量，對作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究。通過本實(shí)驗(yàn)研究NT-3及Trk-C在PSD大鼠小腦表達(dá)研究，可能為拓展PSD的發(fā)病機(jī)制提供新的思路，為PSD治療和預(yù)防提供研究方向。