韓桂香 劉 嘉 朱萱萱 張 迪

（1.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江蘇南京211800；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029）

近年來，因明確的藥理作用和較低的毒副作用，姜黃素（curcumin）及其相關(guān)制劑在皮膚疾病中有較為廣泛的應(yīng)用[1]。有研究認(rèn)為，姜黃素具有清除活性氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化的作用，可防護(hù)人角質(zhì)形成細(xì)胞的氧化損傷，還對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞、人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞具有明顯的抑制作用，也具有明顯的抗炎和抗皮膚微生物的作用[2]。盡管應(yīng)用前景廣泛，但由于姜黃素水溶性低，且在中性pH中不穩(wěn)定，這樣的理化性質(zhì)限制了其進(jìn)一步開發(fā)利用。姜黃素的外用制劑往往因釋藥緩慢，累積釋藥量達(dá)不到治療濃度而影響治療效果[3]?；诖耍覀兺ㄟ^制劑學(xué)的方法改變姜黃素的理化性質(zhì)，將姜黃素制備成新型的載體經(jīng)皮給藥系統(tǒng)——微乳凝膠，對(duì)比姜黃素普通凝膠與姜黃素微乳凝膠對(duì)小鼠皮膚纖維化模型的作用，并深入探討其機(jī)制，以期為姜黃素進(jìn)一步的開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)Balb/c小鼠，雄性，體重20～24g，由北京維通利華提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0003。

1.2 試藥 姜黃素（純度95%，西安四季生物科技有限公司）；聚山梨酯-80（廣州廣醇化工科技有限公司）；辛酸癸酸甘油三酯（德國(guó)BASF）；乙基己基異壬酸酯（上海譽(yù)宇新材料科技有限公司）；油酸（汕頭市西隴化工廠）；泊洛沙姆407（德國(guó)BASF）；無水乙醇（上海久億化學(xué)試劑有限公司）；二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠、30%H2O2，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木素、伊紅，武漢谷歌生物科技有限公司；積雪苷軟膏（積雪總苷含量為0.025g/g，上海現(xiàn)代制藥股份有限公司）；博來霉素（海正輝瑞制藥有限公司）；羥脯氨酸測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）試劑盒，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）檢測(cè)試劑盒，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）檢測(cè)試劑盒，南京拜睿生物科技有限公司。

1.3 儀器 T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）；JJ-12J脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；JB-P5石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016石蠟超薄切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；Nikon DS-U3生物正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康）；JB-L5凍臺(tái)（武漢俊杰電子有限公司）；組織攤片KD-P機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；DNP-9022 37℃恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9108A鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 姜黃素微乳凝膠的制備 以偽三相圖法篩選姜黃素微乳的工藝，微乳制備完成后再制備成凝膠劑。經(jīng)過篩選，姜黃素微乳的最優(yōu)處方為：水相為無水乙醇25%，水53.5%；油相為油酸和乙基己基異壬酸酯的混合物（1∶1）6.8%，表面活性劑為聚山梨酯-80與辛酸癸酸甘油三酯的混合物（1∶3）14.7%。制備方法：將適量姜黃素溶于無水乙醇，配置成10mg/mL的溶液，先后加入表面活性劑和油相，超聲20min后，加入水相，緩慢加入，邊加邊攪，500r/min磁力攪拌45min即得姜黃素微乳。微乳制備完成后，以直接溶脹法制備微乳凝膠，將泊洛沙姆407置于微乳表面，放置4℃冰箱12h，待凝膠基質(zhì)泊洛沙姆407溶脹后，緩慢攪拌，置室溫下即得。姜黃素微乳凝膠含藥量為2.5mg/mL。

2.2 姜黃素凝膠與空白凝膠的制備 將適量姜黃素溶于無水乙醇，以直接溶脹法制備微乳凝膠，制備方法同上，姜黃素凝膠含藥量為2.5mg/mL。將泊洛沙姆407直接溶脹于蒸餾水中即制成空白凝膠。

2.3 小鼠皮膚纖維化模型制備 將70只SPF級(jí)BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、姜黃素微乳凝膠低劑量組、姜黃素微乳凝膠中劑量組、姜黃素微乳凝膠高劑量組、姜黃素凝膠組、陽性藥（積雪苷軟膏）組，每組10只，正常飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，給予SPF級(jí)飼料（由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司提供）飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前用電動(dòng)剃毛剪將背部毛發(fā)剃除，面積1.5cm×1.5cm。采用博來霉素建立小鼠皮膚纖維化模型，用PBS液（pH7.2磷酸鹽緩沖液）將博來霉素（BLM）配置成200μg/mL溶液，經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾除菌后保存?zhèn)溆?。造模時(shí)在小鼠背部中央剃毛處用博來霉素溶液作背部皮內(nèi)注射，每日1次，每次0.1mL，共3周。正常組用PBS液0.1mL注射，方法同造模組。每日記錄皮膚彈性及外觀等大體變化，給藥3周后，觀察造模情況，60只博來霉素皮膚纖維化模型小鼠注射區(qū)皮膚活動(dòng)度明顯減弱，注射區(qū)皮膚與皮下組織粘連，初步確定造模成功。在之后的實(shí)驗(yàn)中處死小鼠，取注射區(qū)皮膚，進(jìn)行組織學(xué)檢查，確認(rèn)造模均成功。

2.4 給藥方案 正常組與模型組給以空白凝膠，0.5mL/次；姜黃素微乳凝膠低、中、高劑量組分別給予姜黃素微乳凝膠0.8、1.6、2.4mg/次；姜黃素凝膠組給予姜黃素凝膠，2.4mg/次；陽性藥組給予積雪苷軟膏，25mg/次。以上各組動(dòng)物在成功造模后的次日開始給藥，每日給藥2次，連續(xù)3周。

2.5 指標(biāo)檢測(cè) （1）動(dòng)物血清中羥脯氨酸含量測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)動(dòng)物取血，2000r/min離心15min，取上清液，測(cè)定羥脯氨酸含量（采用堿水解法，按試劑盒說明書進(jìn)行操作）。（2）處死小鼠，取背部中央約1.5cm×1.5cm大小皮膚，經(jīng)過10%福爾馬林液固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，制片，HE染色，由專業(yè)病理人員在光學(xué)顯微鏡下閱片。應(yīng)用醫(yī)學(xué)彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定真皮厚度，每張切片隨機(jī)取5處測(cè)皮膚厚度，取平均值。（3）免疫組化測(cè)定：ColⅠ、TGF-β、MMP-9，實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說明書操作，棕黃色為陽性表達(dá)，應(yīng)用Image-Pro Plus對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片進(jìn)行分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠羥脯氨酸含量比較 結(jié)果見表1。姜黃素微乳凝膠各劑量組組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

3.2 各組小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察與真皮厚度比較 各組小鼠真皮厚度比較結(jié)果見表2。姜黃素微乳凝膠各劑量組組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。HE染色組織圖見圖1。除正常組外，其他各組小鼠皮膚組織學(xué)顯示真皮層不同程度的增厚，真皮小血管周圍出現(xiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管壁增厚，管腔變小或閉塞，皮膚附屬器明顯減少。陽性藥組和姜黃素微乳凝膠高劑量組真皮纖維化程度明顯減輕，浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞明顯減少；中劑量組和姜黃素凝膠組作用相近，略有改善真皮病變的作用；低劑量組則改善不明顯。

表1 各組小鼠血清羥脯氨酸含量比較（±s）

表1 各組小鼠血清羥脯氨酸含量比較（±s）

注： 與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與陽性藥組比較，#P＜0.05；與姜黃素凝膠組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

正常組 10 0.170±0.004 70.68±1.55模型組 10 0.238±0.039△△ 98.62±16.36△△陽性藥組 10 25 0.162±0.005** 67.12±0.03**姜黃素凝膠組 10 2.4 0.175±0.022**# 72.77±9.03**#姜黃素微乳凝膠低劑量組 10 0.8 0.180±0.011**# 74.53±4.51**#姜黃素微乳凝膠中劑量組 10 1.6 0.160±0.014**▲ 66.49±5.60**▲姜黃素微乳凝膠高劑量組 10 2.4 0.122±0.019ΔΔ**#▲▲ 50.62±7.77ΔΔ**#▲▲

3.3 各組小鼠皮膚組織中ColⅠ、MMP-9和TGF-β表達(dá)比較 結(jié)果 見 表3。 結(jié) 果 顯 示，ColⅠ、MMP-9和TGF-β在模型組表達(dá)顯著升高，在正常組則幾乎無表達(dá)，提示皮膚纖維化與ColⅠ、MMP-9和TGF-β的高表達(dá)有相關(guān)性。姜黃素微乳凝膠各劑量組上述指標(biāo)有不同程度的降低，高劑量組降低最為明顯，且明顯優(yōu)于姜黃素凝膠組（P＜0.05，P＜0.01）。姜黃素微乳凝膠各劑量組組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

4 討論

皮膚纖維化通常發(fā)生于硬皮病與皮膚瘢痕形成過程中，其主要特征為真皮層出現(xiàn)增厚，皮膚附屬器毛囊、汗腺等出現(xiàn)阻塞，真皮小血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管壁明顯增厚，管腔變小或閉塞等[4]。皮膚纖維化是多個(gè)細(xì)胞因子參與的細(xì)胞間相互作用的結(jié)果，通常認(rèn)為與ColⅠ、MMP-9和TGF-β等的異常表達(dá)有關(guān)。TGF-β是目前普遍認(rèn)為與皮膚纖維化相關(guān)的因子，往往參與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡等多個(gè)過程，如TGF-β過高表達(dá)，能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、膠原蛋白、層黏蛋白等的分泌及合成，并抑制其降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（EMC）的沉積[5]，最終導(dǎo)致皮膚纖維化的產(chǎn)生。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族，其主要功能是降解和重塑EMC的動(dòng)態(tài)平衡。MMP-9與組織器官發(fā)生纖維化密切相關(guān)，Vassiliadis等[6]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9中的CO3-610片段與介導(dǎo)Ⅲ型膠原蛋白降解程度直接相關(guān)，在博來霉素皮膚纖維化小鼠中普遍高表達(dá)，提示MMP-9與皮膚纖維化發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)。Kobayashi等[7]發(fā)現(xiàn)，MMP-9可通過激活TGF-β，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生成，進(jìn)而誘發(fā)組織纖維化。羥脯氨酸為膠原蛋白特征性的氨基酸，在創(chuàng)傷愈合及組織纖維化病變等方面有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，相關(guān)研究也常將血清羥脯氨酸含量作為纖維化程度的標(biāo)志[8-9]。Ⅰ型膠原蛋白為結(jié)締組織中的主要成分之一，其主要分布于皮膚和肌腱，是皮膚纖維化的重要指標(biāo)。

表2 各組小鼠真皮厚度比較（±s）

表2 各組小鼠真皮厚度比較（±s）

注： 與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01 ；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 ；與姜黃素凝膠組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 劑量（mg/次） 平均真皮厚度（μm）正常組 10 16.16±0.70模型組 10 48.18±0.57△△陽性藥組 10 25 25.09±4.51△**姜黃素凝膠組 10 2.4 30.85±9.07△△**#姜黃素微乳凝膠低劑量組 10 0.8 38.10±2.36△△*##▲姜黃素微乳凝膠中劑量組 10 1.6 29.83±4.93△△**#姜黃素微乳凝膠高劑量組 10 2.4 24.48±3.21△**▲

圖1 各組小鼠皮膚組織HE染色圖

表3 各組小鼠皮膚組織中的COLⅠ、MMP-9和TGF-β表達(dá)比較（±s）

表3 各組小鼠皮膚組織中的COLⅠ、MMP-9和TGF-β表達(dá)比較（±s）

注： 與正常組比較，△△P＜0.01 ；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與陽性藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與姜黃素凝膠組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）劑量（mg/次） COLⅠ表達(dá)AOD值 MMP-9表達(dá)AOD值 TGF-β的表達(dá)AOD值正常組 10 0.003±0.001 0.036±0.007 0.008±0.002模型組 10 1.388±0.212△△ 1.272±0.077△△ 1.226±0.209△△陽性藥組 10 25 0.408±0.076△△** 0.382±0.085△△** 0.396±0.055△△**姜黃素凝膠組 10 2.4 0.769±0.146△△**# 1.094±0.054△△*## 0.889±0.116△△**##姜黃素微乳凝膠低劑量組 10 0.8 1.239±0.174△△##▲▲ 1.193±0.114△△*## 1.115±0.127△△##▲姜黃素微乳凝膠中劑量組 10 1.6 0.982±0.214△△*##▲ 0.848±0.173△△**## 0.812±0.142△△**##姜黃素微乳凝膠高劑量組 10 2.4 0.503±0.073△△**▲ 0.523±0.106△△**▲▲ 0.587±0.074△△**#▲

姜黃素因具有多靶點(diǎn)的藥理學(xué)作用而備受藥學(xué)界的關(guān)注，其在逆轉(zhuǎn)纖維化方面也有諸多報(bào)道[10-11]。一系列研究證實(shí)，姜黃素可多靶點(diǎn)逆轉(zhuǎn)肝、肺、腎及皮膚的纖維化，涉及基因及蛋白包括IFN-γ、MCP-1、TGF-β、CTGF、VEGF、TNF-α、IL-1、ET-1、AngⅡ等[1]。由此可見，姜黃素在治療纖維化和皮膚病領(lǐng)域有光明的前景。然而，藥物的研發(fā)除了確切的藥理作用和較小的毒性外，還需考慮其理化性質(zhì)及生物藥劑學(xué)特性。姜黃素屬二酮類化合物，主鏈為不飽和脂族及芳香族基團(tuán)，姜黃素不溶于水和乙醚，溶于乙醇和冰醋酸，在乙醇中的溶解度較小，僅為10mg/mL。此外，姜黃素在中性條件下不穩(wěn)定，易水解為阿魏酸甲烷和阿魏酸[12]。姜黃素理化性質(zhì)的缺陷限制了其的進(jìn)一步開發(fā)和利用。以皮膚外用制劑為例，姜黃素雖可透過脂溶性的表皮，但其后在水性環(huán)境中可能釋藥緩慢，甚至尚未到達(dá)作用部位即被分解。因此，改變姜黃素的理化性質(zhì)，對(duì)其的開發(fā)利用十分必要。微乳凝膠（microemulsion-based gels，MBGs）是在微乳中加入明膠、纖維素和卡波姆等水溶性高分子材料，形成透明和穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膠體[13]，是一種復(fù)合制劑，具有延長(zhǎng)藥物維持時(shí)間，改善透皮速率等綜合優(yōu)勢(shì)。因此，將姜黃素制備成微乳凝膠，可有效改善其釋藥特性，增加黏性，改善涂布性和延展性，最終增加藥效。本研究顯示，姜黃素微乳凝膠在減小真皮厚度，降低血清羥脯氨酸含量，降低TGF-β、MMP-9及ColⅠ表達(dá)等方面均優(yōu)于姜黃素凝膠，與陽性藥積雪苷軟膏（積雪苷軟膏為目前臨床治療皮膚纖維化的一線用藥）相似甚至更優(yōu)。后續(xù)的研究應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步優(yōu)化姜黃素微乳凝膠的給藥劑量，并開展相關(guān)制劑的穩(wěn)定性研究和中試生產(chǎn)研究，為姜黃素新劑型的進(jìn)一步開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。