巨修練，王天華，徐聞曦，胡琦薇，舒啟超，鄭小嬌，劉根炎

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205

阿維菌素是通過土壤放線菌發(fā)酵得到的大環(huán)內(nèi)酯類藥物（圖1），這種藥物從根本上降低了河盲癥和淋巴絲蟲病的發(fā)病率，對其它寄生蟲疾病也有出色的防控效果，發(fā)明該化合物的美國科學(xué)家威廉·C·坎貝爾、日本科學(xué)家大村智于2015年獲得諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。阿維菌素類化合物在防治農(nóng)業(yè)害蟲方面也有突出的效果，特別是對小菜蛾、甜菜夜蛾等難防治的害蟲也具有突出的防效。研究表明阿維菌素類化合物作用于谷氨酸門控氯離子通道受體（glutamate-gated chloride ion channel receptor，GluClR），GluClR與甘氨酸受體（glycine receptor，GlyR）、γ-氨基丁酸受體（GAB?AAR、GABACR）、及組氨酸門控氯離子通道受體（histidine-gated chloride ion channel receptor，His?ClR）同屬于抑制性陰離子通道受體，是半胱氨酸環(huán)配體門控離子通道受體超家族中的重要一大類，具有重要的研究價(jià)值。該家族的成員還包括煙堿乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine recep?tor，nAChR）、5-羥色胺3受體（5-hydroxytryptamine type3 receptor，5-HT3R）等激動性陽離子通道受體［1］。研究表明，GluClR僅在無脊椎動物和軟體動物神經(jīng)及肌肉細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。GluClR介導(dǎo)快速的突觸傳遞抑制效應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞及機(jī)體功能［2］，與哺乳動物受體比較，GluClR是研發(fā)安全、高效殺蟲劑的重要靶標(biāo)。

無脊椎動物體內(nèi)的GluClR通道均是由像花瓣一樣的五個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基均含有胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)及胞外區(qū)［3-6］。目前，還未見報(bào)道小菜蛾（Plutella xylostella）GluClR受體的三維結(jié)構(gòu)實(shí)測結(jié)果，本研究采用同源模建的方法，以實(shí)驗(yàn)解析得到的秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）GluClR蛋白三維結(jié)構(gòu)為模板（PDB：3RHW），構(gòu)建小菜蛾GluClR結(jié)構(gòu)模型，并將阿維菌素類化合物與其進(jìn)行對接并與實(shí)測活性比較，研究安全、高效、對人、畜、環(huán)境安全，對害蟲活性高的阿維菌素類衍生物提供理論依據(jù)。

圖1 阿維菌素衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of avermectins derivatives

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 同源模建

通過搜尋PDB數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)已經(jīng)解析得到的小菜蛾GluClR三維結(jié)構(gòu)，但在該數(shù)據(jù)庫中尋找發(fā)現(xiàn)了一個(gè)已經(jīng)解析的秀麗隱桿線蟲（Caenorhab?ditis elegans）的GluClR三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：3RHW at 0.326 nm），可以作為模板。本研究以解析得到的秀麗隱桿線蟲的GluClR三維結(jié)構(gòu)為同源模建的模板，采用同源模建的方法構(gòu)建昆蟲小菜蛾Glu?ClR的三維結(jié)構(gòu)，在模型優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行分子對接研究。

1.2 選擇模板

模建成功的關(guān)鍵是選擇合適的模板，模板蛋白的選擇是否合適將直接影響同源模建獲得的最終結(jié)果，綜合分析模板受體蛋白家族的同源性、完整性及分辨率等因素，最終選擇線蟲（Caenorhab?ditis elegans）的三維結(jié)構(gòu)蛋白（PDB ID：3RHW at 0.326 nm）作為模板。

1.3 選擇序列

為構(gòu)建目標(biāo)蛋白GluClR的三維結(jié)構(gòu)，通過Swiss-Prot/TrEMBL搜尋，得到了比較合適的小菜蛾（Plutella xylostella）GluClR 蛋 白 序 列（GI：397310811）。通過對模板及構(gòu)建序列進(jìn)行比對及合理編輯，去除與本研究無關(guān)的部分膜外區(qū)殘基。

1.4 亞基構(gòu)建

通過在SYBYL-X 2.0程序包的Biopolymer模塊中采用Needleman&Wunsch方法，將線蟲（Cae?norhabditis elegans）模板序列與昆蟲小菜蛾（Plutel?la xylostella）目標(biāo)蛋白序列進(jìn)行序列比對生成多序列對比文件后，在ORCHESTRAR模塊中導(dǎo)入MSF文件，進(jìn)行識別并構(gòu)建結(jié)構(gòu)保守區(qū)、結(jié)構(gòu)可變區(qū)，添加側(cè)鏈等［7-8］。

1.5 亞基組合

GluClR為同源五聚體結(jié)構(gòu)蛋白，因此，將所構(gòu)建的亞基依次按一定順序一一對應(yīng)疊合到模板的5個(gè)亞基上并使用MERGE模塊完成亞基的組合即可。

1.6 模型優(yōu)化

使用分子力學(xué)及分子動力學(xué)對所構(gòu)建的小菜蛾GluClR三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化和修正，使模建得到的GluClR三維結(jié)構(gòu)具有合理性，可以進(jìn)行下一步研究。首先在AMBER FF99力場下采用共軛梯度法（Cojugate Gradient Method）進(jìn)行體系的能量優(yōu)化，使能量梯度最后收斂值小于5 kcal·nm/mol，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分子動力學(xué)模擬（dynamics simula?tioin），其中設(shè)定300 K恒溫，1.01×105Pa壓力，1 fs步長，弛豫1000 ps進(jìn)行計(jì)算，最終檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定性。

1.7 分子對接

分子對接過程的關(guān)鍵是選擇合理的受體結(jié)合模式，這將直接影響對接結(jié)果。本研究參考模板配體與受體結(jié)合位點(diǎn)，采用自定義氨基酸殘基模式確定受體結(jié)合口袋。在SYBYL-X 2.0程序包的Surflex-docking模塊中［9-10］，使用原型分子（proto?mol）為結(jié)合口袋，參數(shù)Bloat值和Threshold值確定其結(jié)合口袋形狀及大?。?1］。

將阿維菌素、伊維菌素、?，斁胤謩e與同源模建得到的小菜蛾GluClR三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接，研究通過生物發(fā)酵得到的殺蟲劑阿維菌素及其衍生物與昆蟲小菜蛾GluClR的相互作用模式及作用機(jī)理。

2 結(jié)果與討論

2.1 同源模建

昆蟲小菜蛾（Plutella xylostella）GluClR的亞基序列（GI：397310811）與作為模板的秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）GluClRA鏈序列的序列比對結(jié)果如圖2所示。小菜蛾GluClR序列與麗隱桿線蟲模板序列相似度較高，二者序列同源性為65.12%，而模建研究表明，一般情況下，模板蛋白序列與構(gòu)建的目標(biāo)蛋白序列同源性大于30%時(shí)，即可以通過同源模建方法獲得可靠的目標(biāo)蛋白三維結(jié)構(gòu)模型［12］。在本研究中，針對同源模建昆蟲小菜蛾的GluClR三維結(jié)構(gòu)的目的，采用秀麗隱桿線蟲GluClR的三維結(jié)構(gòu)蛋白作為模板是合理可行的。

圖2 昆蟲小菜蛾與秀麗隱桿線蟲的GluClR序列疊合對比結(jié)果Fig.2 Sequence comparation of Plutella xylostella and Caenorhabditis elegans GluClRs

通過分析，秀麗隱桿線蟲的GluClR為同源五聚體組成的離子通道蛋白受體，5個(gè)亞基序列一致。通過二者序列比對、構(gòu)建結(jié)構(gòu)保守區(qū)、結(jié)構(gòu)可變區(qū)、側(cè)鏈和模型優(yōu)化后，獲得了GluClR其中1個(gè)亞基，將模建所得的小菜蛾GluClR亞基分別疊合到編輯之后的模板的亞基上，組裝成為昆蟲小菜蛾的GluClR三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)構(gòu)如圖3（a）所示。

相對于同源模建獲得的模型，還需對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子力學(xué)及分子動力學(xué)研究［13］。在能量優(yōu)化方面，使用了SYBYL-X 2.0軟件包中的Dynamics模塊對其進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，同源模建所獲得的昆蟲小菜蛾GluClR三維結(jié)構(gòu)的勢能在10 ps之后逐漸趨于穩(wěn)定在9000 kcal/mol左右；昆蟲小菜蛾GluClR三維結(jié)構(gòu)骨架原子的位置相對于模型最初構(gòu)象的均方根差（root mean square deviations，RMSD）在昆蟲小菜蛾三維結(jié)構(gòu)模型中的RMSD值在最初階段逐漸上升，在200 ps之后，RMSD值穩(wěn)定在0.55 nm左右，表明體系已趨于穩(wěn)定，說明該模型在能量上是合理的。在構(gòu)象研究方面，采用SYBYL-X 2.0程序中的Protein Analyze模塊內(nèi)Ra?machandran Plot對同源模建所得到的昆蟲小菜蛾（Plutella xylostella）GluClR三維結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)象進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖 3（b）所示，拉氏圖 Ramachan?dran Plot是組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基理論上可以出現(xiàn)的構(gòu)象，檢測同源模建模型的質(zhì)量［11］。本研究中模建所獲得的昆蟲小菜蛾GluClR的三維結(jié)構(gòu)模型的全部氨基酸殘基均處于允許區(qū)域內(nèi)，證明該模型在構(gòu)象上也是合理的，完全可以用于分子對接的下一步研究。

圖3 小菜蛾GluClR：（a）模建結(jié)構(gòu)，（b）模型拉氏圖Fig.3 （a）The modeling structure and（b）Ramachandran graph of Plutella xylostella GluClR

2.2 分子對接

參照文獻(xiàn)報(bào)道采用殘基模式定義結(jié)合口袋［14］，殘基中包括 A 鏈的 Tyr4，Leu6，Ile7，Gln8，Ile11，Pro12，Met15，Gln48及 E 鏈 的 Ala46，Ser50，Asn53，Asp66，Val67，Ter69，Gly70，Leu73，Phe77，在Surflex-docking模塊下，活性位點(diǎn)被稱為protomol，threshold與 bloat為默認(rèn)值［11］。

采用SYBYL-X 2.0程序中的Surflex-docking模塊進(jìn)行分子對接研究，cscore模塊會分別對3個(gè)配體（EMA、IVM、AVM）與模建得到的受體對接結(jié)果分別進(jìn)行打分，評價(jià)對接結(jié)果。最終的總打分將以-lg10Kd的形式給出，Kd為配體的解離常數(shù)。結(jié)合自由能與Kd的關(guān)系如下：

Free Energy of Binding=RTlnKd

從以上3個(gè)化合物與小菜蛾GluClR的對接結(jié)果來看，Total Score值從高到低依次為?，斁兀?.60）、伊維菌素（9.33）、阿維菌素（8.59），其模擬結(jié)果與該類化合物實(shí)測對小菜蛾的觸殺致死率?，斁兀?.33 mg/g）、伊維菌素（0.39 mg/g）、阿維菌素（0.56 mg/g）一致［15］，如表1所示。

表1 阿維菌素類化合物對昆蟲小菜蛾（Plutella xylostella）的觸殺致死率及對接打分Tab.1 Mortality and total score of AVMs to Plutella xylostella

?，斁?、伊維菌素、阿維菌素與小菜蛾Glu?Cl的對接位點(diǎn)及結(jié)合模式如圖4所示。

圖4表明，阿維菌素類化合物（EMA、IVM、AVM）與昆蟲小菜蛾GluClR的對接模式相似，都是如“楔子”一般嵌入到昆蟲小菜蛾GluClR的相鄰亞基的TM1和TM3之間的靠近外膜區(qū)空隙，并且都是二糖部分完全嵌入空隙之內(nèi)，如圖4所示，埃瑪菌素（EMA）與小菜蛾GluClR的對接中，由于二糖部分甲氨基的引入，使氨基氫與E/SER50的羥基氧形成氫鍵，另外，氨基旁四氫吡喃環(huán)上O與E/SER49側(cè)鏈羥基H形成氫鍵［圖 4（a）］。伊維菌素（IVM）與該受體的對接中二糖部分末端羥基H與E/SER50側(cè)鏈羥基O形成氫鍵，二糖部分末端羥基H與E/ALA46骨架羰基O形成氫鍵［圖4（b）］。而在阿維菌素（AVM）與該受體的對接中僅有二糖部分末端羥基H與E/SER50側(cè)鏈羥基O形成氫鍵［圖4（c）］。Total Score值從高到低依次為?，斁兀?.60）、伊維菌素（9.33）、阿維菌素（8.59），其中?，斁嘏c伊維菌素打分相近且明顯大于阿維菌素，其結(jié)果與該類化合物對小菜蛾的觸殺致死率?，斁兀?.33 mg/g）、伊維菌素（0.39 mg/g）、阿維菌素（0.56 mg/g）的實(shí)測活性一致［15］。

圖4 阿維菌素類藥物與小菜蛾GluClR對接圖：（a）EMA，（b）IVM，（c）AVMFig.4 Docking results of avermectins with GluClR of Plutella xylostella：（a）EMA，（b）IVM，（c）AVM

3 結(jié) 語

本研究以文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)解析得到的秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）谷氨酸門控氯離子通道為模板，同源模建了昆蟲小菜蛾（Plutella xylo?stella）氯離子通道受體三維結(jié)構(gòu)，經(jīng)分子力學(xué)及分子動力學(xué)研究，證明模型的合理性。將模建獲得的小菜蛾氯離子通道受體與阿維菌素類衍生物埃瑪菌素、伊維菌素和阿維菌素分別進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)對接打分結(jié)果與實(shí)測殺蟲結(jié)果一致。研究結(jié)果可為了解作用于GluClR殺蟲劑的作用機(jī)理及設(shè)計(jì)用于該受體的殺蟲劑提供理論依據(jù)。