朱麗娜，張佑紅，盧育兵，錢澤棟

武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢430205

我國是煤炭大國，煤炭在我國能源結(jié)構(gòu)中占據(jù)相當(dāng)重要的地位［1-3］。近年來我國煤化工產(chǎn)業(yè)得到了迅速發(fā)展，然而煤化工污染治理問題成為了亟需解決的重點(diǎn)問題［4］。煤氣化是煤炭高效潔凈利用的關(guān)鍵技術(shù)，氣化過程中會產(chǎn)生大量高濃度、高污染、有毒、難降解的工業(yè)有機(jī)廢水，其水質(zhì)因所使用的原料煤的成分和煤氣化工藝的不同而有較大的差異［5-9］。大量的煤氣化廢水如果不經(jīng)處理直接排放，會對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成巨大的危害［10］。目前，我國對煤氣化廢水的處理采用三級處理工藝，即“物化預(yù)處理→生物處理→物化深度處理”，生物處理因處理費(fèi)用低、操作簡單、不易造成二次污染等特點(diǎn)，受到了廣泛的關(guān)注［11-16］。為了研究利用微生物方法解決煤氣化廢水中化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）和氨氮的污染問題，本研究以苯酚為唯一碳源，從寧夏某煤氣化工廠生化反應(yīng)池排放的活性污泥中分離篩選出煤氣化廢水降解菌，對其降解性能進(jìn)行研究，并選擇優(yōu)勢降解菌進(jìn)行鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

1.1.1 菌種的來源 寧夏某煤氣化工廠生化反應(yīng)池排放的活性污泥。

1.1.2 廢水的來源 由于實(shí)際廢水的水質(zhì)波動(dòng)比較大，不利于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行理論研究。綜合考慮試驗(yàn)精度和實(shí)際工業(yè)應(yīng)用要求，查閱文獻(xiàn)后采用模擬廢水進(jìn)行理論研究。1000 mL模擬廢水的成分為：葡萄糖10.0 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，硫酸銨0.21 g，磷酸二氫鉀 1.0 g，硫酸鎂 0.2 g，磷酸氫二鉀 1.0 g，氯化鈣 0.1 g，原始煤氣化廢水50 mL，超純水950 mL。原始煤氣化廢水取自寧夏某煤氣化工廠未經(jīng)處理的實(shí)際廢水。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 BS124S分析天平，PB-10 pH計(jì)，Sartorius；YXQ-LS-75S立式蒸汽壓力滅菌鍋，DZF-6050真空干燥箱，SPX-250B-D振蕩培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；MFS-Ⅱ多功能三維旋混儀（深圳潘西諾生物科技有限公司）；TDZ5-WS臺式多管低速離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）；AIR TECH超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)耗材 100 μL、200 μL、1000 μL的移液槍頭（Corning公司）；移液槍（Nichiryo公司）；COD檢測試劑盒，氨氮專用檢測試紙（杭州陸恒生物科技有限公司）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑 牛肉膏、大豆蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硝酸銨、氯化鈣、濃鹽酸、氫氧化鈉、七水合硫酸亞鐵、氯化鈉、瓊脂粉、苯酚，其中牛肉膏、大豆蛋白胨、瓊脂粉為生化試劑；其他試劑均為分析純。

1.3 培養(yǎng)基配制

富集培養(yǎng)基：蒸餾水1 L，蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%；調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：蒸餾水1 L，硫酸亞鐵（硫酸亞鐵銨）0.01 g，硝酸銨 1 g、磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸氫二鉀 1.0 g，氯化鈣 0.1 g；調(diào)節(jié) pH 至7.0～7.2。

馴化培養(yǎng)基：1 L無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加100 mL的模擬廢水和0.1 g苯酚。

篩選培養(yǎng)基：1 L無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加100 mL的模擬廢水和0.1 g苯酚。

固體培養(yǎng)基：馴化培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂粉。

純化培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂粉。

滅菌方法：培養(yǎng)基、玻璃平板、移液槍槍頭通過高壓蒸汽滅菌鍋，在0.103 MPa下，121℃滅菌20 min；超凈工作臺、涂布棒、接種環(huán)通過紫外燈照射，滅菌30 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌株的馴化與富集 取一定量的活性污泥至500 mL的燒杯中，加入100 mL馴化培養(yǎng)基，于30℃下培養(yǎng)15 d。在培養(yǎng)的過程中，馴化培養(yǎng)基會逐漸被微生物分解利用，水分也會被蒸發(fā)一部分，因此每天應(yīng)觀察污泥的狀態(tài)并適當(dāng)?shù)臄嚢?，及時(shí)補(bǔ)充適量的馴化培養(yǎng)基和超純水，以保證污泥被馴化培養(yǎng)基浸沒達(dá)到馴化與富集的效果。

1.4.2 菌株的分離與純化 由于煤氣化廢水中一般含有較高濃度的酚類物質(zhì)，因此在篩選平板中加入酚類物質(zhì)，一方面能使適應(yīng)酚環(huán)境并利用酚類物質(zhì)的菌株快速生長，另一方面還能抑制不適應(yīng)酚環(huán)境的菌株的生長。本實(shí)驗(yàn)選用以苯酚為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基，通過平板劃線分離純化。具體步驟如下：在超凈工作臺中，吸取100 μL馴化后的富集菌液，然后吸取900 μL的滅菌超純水，將菌株稀釋10倍，同樣步驟將稀釋液再分別稀釋10-2、10-3、10-4倍，然后吸取 100 μL稀釋了 10-3倍和10-4倍的菌液，加入到篩選培養(yǎng)基平板當(dāng)中，用涂布棒分別均勻涂開稀釋液，然后將平板倒置在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h，挑選比較大一點(diǎn)或不同顏色特征的菌落分別進(jìn)行平板劃線。為了得到單一的菌株，反復(fù)使用純化培養(yǎng)基平板轉(zhuǎn)接，分離多次，直到完全的分離，對分離得到的菌株進(jìn)行編號。

1.4.3 菌株降解效果的測定 在100 mL的富集培養(yǎng)基中分別接種上述篩選分離純化后的菌株，于30℃、160 r/min下培養(yǎng)24 h。吸取5 mL富集后的菌液，接種于100 mL的模擬廢水中，同時(shí)設(shè)置空白對照組，空白對照組為5 mL的滅菌模擬廢水。設(shè)置菌株降解條件為：溫度30℃、轉(zhuǎn)速160 r/min，72 h后吸取5 mL溶液，5000 r/min離心10 min，取上清液，使用COD檢測試劑盒和氨氮專用檢測試紙測定廢水中COD和氨氮的含量，根據(jù)菌株對廢水中COD和氨氮的降解效果挑選出一株降解能力較強(qiáng)的菌株。

1.4.4 優(yōu)勢降解菌降解性能的測定 對篩選出的優(yōu)勢降解菌富集培養(yǎng)24 h后，接種到400 mL廢水中，接種量為5%，轉(zhuǎn)速160 r/min，溫度30℃，分別在0 h，4 h，8 h，12 h，18 h，36 h，72 h取樣5 mL，使用COD檢測試劑盒和氨氮專用檢測試紙，測定廢水中的COD和氨氮含量，并計(jì)算降解率。

1.4.5 煤氣化廢水優(yōu)勢降解菌的分子生物學(xué)鑒定

本實(shí)驗(yàn)通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，最終確定菌株種屬。其鑒定過程具體如下：

1）細(xì)菌總DNA的提取

將平板上分離純化得到的單菌落R接種到富集培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min下培養(yǎng)24 h，取10 mL菌液，用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）進(jìn)行提取。

2）PCR（polymerase chain reaction，PCR）引物

PCR擴(kuò)增的DNA片段引物采用16S rDNA通用引物。

27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

3）PCR擴(kuò)增體系

用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

DNA 模板（基因組 DNA 20 ng/μL～50 ng/μL）2 μL，10×Buffer（with Mg2+）5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶為 0.25 μL，上游引物 27F（10 μmol/L）2.5 μL，下游引物 1 492R（10 μmol/L）2.5 μL，dd H2O 33.75 μL，體系總體積為50 μL。

循環(huán)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)后再在72℃修復(fù)延伸10 min。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA，20 min電泳觀察。

4）16S rDNA測序和同源性分析

16S rDNA測序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。測序結(jié)果利用美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Infor?mation，NCBI）上的BLAST程序進(jìn)行相似性比對分析，然后從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取同源性較高的10株菌株，利用Mega5.0 N-J軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選結(jié)果及降解性能的研究

以苯酚為唯一碳源從寧夏某煤氣化工廠生化池的活性污泥中篩選得到3株菌株，分別命名為R，X，Y。分別測定3株菌株對煤氣化廢水中的COD和氨氮的降解效果，結(jié)果如圖1（a）所示。從圖1（a）中可以發(fā)現(xiàn)，3株菌株對廢水中COD和氨氮均具有一定的降解效果。對于COD的降解：菌株R＞X＞Y，菌株R的降解效果最好，廢水中COD含量降到了500 mg/L，降解率為50%；對于氨氮的降解：菌株R＞X=Y，菌株R的降解效果最好，廢水中氨氮含量降為270 mg/L，降解率為46%。與菌株X和Y相比，菌株R有明顯的優(yōu)勢，所以確定菌株R為優(yōu)勢菌株，將做進(jìn)一步降解性能的研究和鑒定。

對菌株R降解性能的測定，得到的結(jié)果如圖1（b）。從COD的降解率曲線可以看出，在0 h～18 h時(shí)，COD降解率明顯提高，18 h～72 h時(shí)，COD降解率趨于穩(wěn)定，達(dá)到了50%；從氨氮的降解率曲線可以看出，在0 h～8 h時(shí)，氨氮的降解率較緩慢地提高；在8 h～18 h時(shí)，氨氮的降解率較明顯地提高；在18 h～36 h時(shí)，氨氮的降解率提高逐漸減慢；在36 h～72 h時(shí)，氨氮的降解率趨于穩(wěn)定，達(dá)到了46%。

圖1 （a）菌株的篩選結(jié)果，（b）菌株R的降解性能Fig.1 （a）Screening results of strains，（b）degradation performance of strain R

2.2 菌株R的形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定

將菌株R接種在純化培養(yǎng)基中，涂布平板，在30 ℃下培養(yǎng)48 h得到圖2（a）。從圖2（a）可以看到：R菌菌落較大，呈乳白色規(guī)則的圓形，表面凸起且光滑，挑取時(shí)帶有黏性。

菌株R的16S rDNA片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶如圖2（b）所示，其條帶長度約為1200 bp。利用BLAST程序?qū)⒕闞的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示菌株R與枯草芽孢桿菌的相似性達(dá)99%。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2（c）所示，系統(tǒng)發(fā)育樹可以清晰反映菌株的親緣關(guān)系，由圖2（c）可見，菌株R與芽孢桿菌屬（Bacillussp.）的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)99%。再結(jié)合菌落形態(tài)特征，菌株R鑒定為枯草芽孢桿菌。

圖2 菌株R：（a）菌落形態(tài)，（b）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜，（c）16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Strain R：（a）colony morphology，（b）electrophoretogram of PCR amplification products，（c）phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

3 結(jié) 語

近年來，由于我國煤化工產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和人們環(huán)保意識的不斷提高，煤氣化廢水的處理問題引起了社會的高度重視。本研究分離篩選出了1株對煤氣化廢水中COD和氨氮降解效果較優(yōu)的菌株R，其在30℃、160 r/min的條件下降解廢水72 h，廢水中COD降解率為50%，氨氮降解率為46%。對菌株R進(jìn)行形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果顯示菌株R為枯草芽孢桿菌。

廢水的生物處理法是利用微生物自身的生化作用和代謝過程來氧化分解廢水中的污染物質(zhì)，因此后續(xù)可對菌株R進(jìn)行誘變，優(yōu)選出生長代謝、繁殖能力強(qiáng)的菌株，從而提高廢水處理的效果，同時(shí)可嘗試固定化等處理方法，為實(shí)際廢水治污工程提供理論支撐。