李國泰，李學(xué)麗

(通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林 通化 134002)

玉竹[Polygonatumodoratum(Mill.)Druce]，為百合科黃精屬多年生草本植物[1]，原產(chǎn)中國西南地區(qū)，但野生分布很廣。耐寒，亦耐陰，喜潮濕環(huán)境，適宜生長于排水條件較好，土壤肥沃疏松以及土層深厚地區(qū)[2]。植物的根莖具有很重要的藥用價(jià)值，用秋水仙素誘導(dǎo)其染色體數(shù)目加倍，并采用常規(guī)的染色體壓片方法[3]對玉染色體進(jìn)行核型分析，得到人工培育和鑒定玉竹多倍體的方法。加速優(yōu)質(zhì)玉竹的育種進(jìn)程，為藥物研發(fā)提供新材料；也可以為人工誘發(fā)植物多倍體提供理論依據(jù)；還可以為玉竹的育種、開發(fā)及利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料玉竹采集于通化師范學(xué)院后山。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程與方法

1.2.1 玉竹根尖的預(yù)處理[4]

(1)脫脂棉包裹法：將玉竹幼苗根部清洗干凈， 用浸透0.1%秋水仙素溶液的脫脂棉包裹玉竹幼苗根部，并用塑料袋包裹防止水分蒸發(fā)。

(2)浸漬法：將玉竹幼苗根部清洗干凈，放入裝有0.1%秋水仙素溶液的錐形瓶中，并在瓶口塞脫脂棉防止秋水仙素蒸發(fā)。

(3)正常培養(yǎng)：將玉竹幼苗栽于花盆中培養(yǎng)。

定期為玉竹幼苗補(bǔ)充秋水仙素及水分，觀察其生長情況，并檢查其根尖變化情況。

1.2.2 玉竹根尖的固定。培養(yǎng)2周之后，待幼苗嫩根膨大，長到1～2cm時(shí)，即可對根尖進(jìn)行固定。

固定：于9:30～11:30細(xì)胞分裂旺盛時(shí)[5]，分別取出經(jīng)過上述3種預(yù)處理的玉竹幼苗，剪取嫩根尖1cm長，將根尖分別放在3個(gè)裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中水洗3次，每次水洗3min，配制卡諾固定液[6]，即無水乙醇(95%乙醇)∶冰乙酸=3∶1的比例均勻混合倒入廣口瓶中，在4℃下，將水洗過的根尖放入卡諾固定液中進(jìn)行固定，固定24h。

1.2.3 玉竹根尖的保存。將固定后的根尖取出并水洗，放入60%的乙醇水溶液中保存。

1.2.4 解離

(1)配制解離液，濃鹽酸∶無水乙醇=1∶1，即無水乙醇與等量的濃鹽酸混合配成解離液。

(2)取3個(gè)小燒杯，分別倒入多半杯解離液,置于 61～62℃的恒溫水浴鍋中, 當(dāng)燒杯中解離液的溫度恒定在 60℃時(shí), 將備用的嫩根尖用鑷子放入其中(1～2個(gè)), 60℃恒溫處理 12～21min,解離時(shí)間結(jié)束后，迅速取出小燒杯，用鑷子將根尖轉(zhuǎn)移到裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中水洗4次, 每次2min，徹底洗去鹽酸，解離過程就完成了。

1.2.5 染色及壓片。取一張干凈的磨砂載玻片，用鑷子夾取解離后的玉竹根尖置于載玻片中央，用吸水紙吸取根尖上殘留的蒸餾水，然后用解剖針切取乳白色的根尖，用滴管吸取適量的改良的石碳酸品紅染液滴加到根尖上[7]，染色時(shí)間為8min，染色結(jié)束后用膠頭滴管吸取45%的醋酸溶液洗片，接下來取一張干凈的蓋玻片蓋在分生組織上，用吸水紙吸取多余的溶液，在蓋玻片上覆一張吸水紙，用大拇指輕輕按壓，把根尖均勻的壓散后，用指尖進(jìn)行刮片，使染色體均勻分散開，便于觀察；將壓好的裝片置于顯微鏡下觀察，把效果好的裝片貼上標(biāo)簽備用。

1.2.6 制作永久裝片。冷凍法揭片：將裝片放入冰箱中冷凍，24h后取出，迅速用解剖刀將蓋玻片揭下來，待載玻片與蓋玻片都干燥，用玻璃棒蘸取米粒大小的中性樹膠滴在載玻片上，用鑷子夾住蓋玻片，按照揭片時(shí)留下的痕跡再重新蓋回去，然后將裝片放在水平的位置自然干燥，待中性樹膠干燥之后，即完成永久裝片的制作[8]。

1.2.7 鏡檢及圖像采集。用電子顯微鏡觀察永久裝片，找到中期染色體，由于染色體非常小，所以需要借助油鏡觀察，在裝片上滴加鏡油(液體石蠟)然后轉(zhuǎn)換100倍的物鏡觀察，用數(shù)碼相機(jī)取染色體分散良好、著絲點(diǎn)清晰的圖像進(jìn)行顯微攝影,拍下有絲分裂各時(shí)期的圖像和分散較好的一組中期染色體圖像，沖洗放大后得到染色體清晰的照片。

1.3 多倍體的誘發(fā)及制作裝片

將玉竹幼苗洗凈后分為3組，以0.1%的秋水仙素為誘變劑，第一組和第二組分別采取脫脂棉包裹法和浸漬法，誘導(dǎo)玉竹幼苗根尖的染色體加倍：將第三組玉竹幼苗栽于花盆中培養(yǎng)，作空白對照。定期對上述3組玉竹幼苗，補(bǔ)充秋水仙素及水分，檢查第一組和第二組玉竹幼苗根尖變化情況以及第三組玉竹幼苗生長狀況；2周后待根尖末端膨大，長度達(dá)到1～3cm時(shí)進(jìn)行固定：于上午9:30～10:30取出玉竹幼苗，用解剖刀切取嫩根尖1cm，將根尖放入裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中水洗3次，將水洗過的根尖放入裝有卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)的廣口瓶中，固定24h,將水洗過的根尖放入65%乙醇溶液中保存。將根尖放入盛有多半杯解離液(濃鹽酸∶無水乙醇=1∶1)的燒杯中,置于 61～62℃的恒溫水浴鍋中, 恒溫處理 12～21min,取出小燒杯，用鑷子將根尖轉(zhuǎn)移到裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中水洗4次, 每次2min，徹底洗去鹽酸，鑷子夾取根尖置于磨砂載玻片中央，用解剖刀切取根尖，吸水紙吸干水分，取改良的石碳酸品紅染液滴加到分生組織上，染色時(shí)間8min，染色結(jié)束后用膠頭滴管吸取45%的醋酸溶液洗片；蓋片，覆一張吸水紙用指尖刮片，使染色體分散均勻；將裝片放入冰箱中冷凍24h后，取出并揭下蓋玻片，待玻片干燥，用玻璃棒蘸取米粒大小的中性樹膠滴在載玻片上，按照揭片時(shí)留下的痕跡將蓋玻片重新蓋上，水平放置使其自然干燥，待中性樹膠干燥后收起備用；鏡檢時(shí)，用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行顯微攝影，拍下分散較好的各時(shí)期染色體圖像。

2 結(jié)果與分析

玉竹(多倍體)染色體計(jì)數(shù)。

圖1 玉竹(四倍體)

用0.1%的秋水仙素處理過的玉竹幼苗，誘發(fā)得到的多倍體的根尖與二倍體在外部形態(tài)上有所不同，其分生區(qū)膨大，短小而粗壯，制作永久裝片后，通過顯微攝影，采集加倍的玉竹有絲分裂中期的染色體圖片，沖洗照片如圖1。

自然條件下玉竹幼苗中期染色體圖片如圖2

通過觀察并計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，用0.1%的秋水仙素誘發(fā)的玉竹的染色體數(shù)目2n=4x=40，而自然培養(yǎng)的玉竹染色體數(shù)目為2n=2x=20，證明此多倍體為四倍體，染色體發(fā)生加倍。

圖2 玉竹(二倍體)

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

自然條件下，玉竹染色體數(shù)目為2n=2x=20，二倍體核型公式為2n=2x=16m+6sm，而用0.1%的秋水仙素處理玉竹幼苗，誘發(fā)多倍體，通過根尖壓片方法對玉竹進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示染色體數(shù)目為2n=4x=40，說明誘發(fā)出了四倍體。通過對比發(fā)現(xiàn)，采用脫脂棉包裹的玉竹幼苗根尖加倍效果明顯，但發(fā)生加倍的根尖較少，采用浸漬法的根尖基本全部發(fā)生加倍，但效果較浸漬法略差。原因可能為脫脂棉包裹法大致還原了玉竹的生長環(huán)境，適于其生長。而浸漬法玉竹根尖呼吸不充分，因此效果略差。

3.2 討論

目前，秋水仙素(colchicine)是誘變多倍體最好的藥劑之一，廣泛應(yīng)用于多倍體誘發(fā)上，秋水仙素的作用是通過與微管蛋白二聚體結(jié)合,而使紡錘體微管蛋白不能繼續(xù)聚合 ,并引起原有紡錘體微管解聚，染色體不能向兩極移動(dòng)，染色單體就不分裂，使得染色體數(shù)目加倍，形成多倍體。由于秋水仙素誘變作用只在細(xì)胞分裂時(shí)期，對于那些處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞沒有作用，因此，本實(shí)驗(yàn)以玉竹幼苗根尖為實(shí)驗(yàn)材料，誘導(dǎo)染色體數(shù)目加倍。

目前生態(tài)環(huán)境破壞嚴(yán)重，野生藥用植物資源逐漸減少甚至枯竭，加強(qiáng)藥用植物多倍體培育,可以緩解這些問題。因此,多倍體誘導(dǎo)技術(shù)應(yīng)用于藥用植物具有深遠(yuǎn)的意義。近年來，玉竹的人工栽培逐漸受到人們重視，具有極高的市場價(jià)值潛力。玉竹的成功加倍，會(huì)提高人工栽培的產(chǎn)量和品質(zhì)，有很好的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)對玉竹的遺傳育種也提供了理論基礎(chǔ)。