郝慧禎，曹建民，曹 卉，艾 坤，徐 鵬

（1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)體育學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022；2.北京體育大學(xué)，北京 100084）

超負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)會(huì)引起一系列的不良身體反應(yīng)，其中包括腸道應(yīng)激綜合征和急性肝損傷。一次性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)作為一種生理應(yīng)激還會(huì)引起肝細(xì)胞血流的改變，從而導(dǎo)致不同程度的肝細(xì)胞缺氧，致使肝組織損傷。有大量研究證明，通過益生菌代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以為腸道細(xì)胞提供營養(yǎng)，改善腸粘膜的通透性，從而改善腸道功能，降低細(xì)菌異位程度。由于肝腸軸的存在，腸道功能紊亂會(huì)致使肝臟功能受到影響。因此，補(bǔ)充益生菌來達(dá)到維持腸道功能正常的目的對(duì)保護(hù)肝臟有積極且重要的影響。本文擬通過一次性大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)作為應(yīng)激刺激，在不同時(shí)間點(diǎn)取材，測(cè)試實(shí)驗(yàn)組（益生菌組）和對(duì)照組（蒸餾水組）小鼠在游泳運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間點(diǎn)的血液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Transaminase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Aminotransferase，AST）和肝臟組織中腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，iNOS）的濃度，觀察補(bǔ)充鼠李糖乳桿菌是否有加速上述指標(biāo)恢復(fù)的效果。在競技體育和大眾健身中，為補(bǔ)充益生菌緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞和免疫力下降等情況提供理論參考依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

鼠李糖乳桿菌對(duì)一次性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠肝損傷的保護(hù)作用。

1.2 運(yùn)動(dòng)模型

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為SPF級(jí)雄性BALB/C 小鼠（鼠齡6～8 周，體重18～22g）48只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證編號(hào)SCXK（京）2012—0001。小鼠隨機(jī)分為8組，每組8只，為蒸餾水安靜組（c1）、蒸餾水運(yùn)動(dòng)后3h組（c2）、蒸餾水運(yùn)動(dòng)后12h組（c3）、蒸餾水運(yùn)動(dòng)后24h組（c4）和益生菌安靜組（y1）、益生菌運(yùn)動(dòng)后3h組（y2）、益生菌運(yùn)動(dòng)后12h組（y3）和益生菌運(yùn)動(dòng)后24h組（y4）。實(shí)驗(yàn)共19d，各組小鼠連續(xù)灌胃2周。采用鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnosus GG，LGG），用蒸餾水稀釋濃度為109CFU/ml，每只小鼠按5ml/kg體重灌胃。安靜組不進(jìn)行任何訓(xùn)練，其他組進(jìn)行2次適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，每隔2d進(jìn)行1次，最后一次性負(fù)重6%進(jìn)行游泳訓(xùn)練，小鼠力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)按Thomas 報(bào)道之文獻(xiàn)。然后按照實(shí)驗(yàn)安排處死。采用100cm×50cm×60cm的泳槽作為小鼠游泳訓(xùn)練裝置，水深50cm，水溫（31±2）℃。第1d：稱重，分組，編號(hào)，適應(yīng)性飼養(yǎng)；第2～第4d：適應(yīng)性飼養(yǎng)；第5～第18d：9：00—各組小鼠按5ml/kg體重灌胃。第12開始進(jìn)行運(yùn)動(dòng)組2次適應(yīng)性訓(xùn)練，最后進(jìn)行一次性負(fù)重6%游泳訓(xùn)練，具體訓(xùn)練取材安排，見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器 分光光度計(jì)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑 （1）一氧化氮試劑盒；（2）一氧化氮合酶測(cè)定試劑盒；（3）丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑；（4）天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒；（5）小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析試劑盒。

1.4 標(biāo)本制備

1.4.1 血清制備 小鼠乙醚麻醉，眼眶靜脈取血，離心取上層血清分裝，－80℃超低溫冰箱凍存。

1.4.2 組織取樣 各組小鼠根據(jù)實(shí)驗(yàn)安排處死，取肝左側(cè)葉，保存于超低溫冰箱。取樣本0.2g，剪碎后按照1∶9的比例加入9%的生理鹽水，用電動(dòng)勻漿機(jī)在冰水浴中進(jìn)行勻漿。提取上層清液，即制備10%組織勻漿液。

表1 小鼠游泳訓(xùn)練取材方案

表2 安靜組與運(yùn)動(dòng)組ALT、AST活性結(jié)果統(tǒng)計(jì) U/L n=6+s

表2 安靜組與運(yùn)動(dòng)組ALT、AST活性結(jié)果統(tǒng)計(jì) U/L n=6+s

注：a表示與c1相比有高度顯著性差異（P＜0.01），b表示與y1相比有高度顯著性差異（P＜0.01），c表示與c2相比有高度顯著性差異（P＜0.01），d表示與c3相比有高度顯著性差異（P＜0.01），e表示與c4相比有高度顯著性差異（P＜0.01）。

組別ALT AST 124±5.22 137±2.01a 111±3.02 121±1.70b 137±2.01 121±1.70c 96.4±2.38 82.5±5.55d 81.4±1.72 63.8±2.69e c1 c2 y1 y2 c2 y2 c3 y3 c4 y4 67.9±2.84 76.1±2.93a 52.0±3.05 64.7±2.55b 76.1±2.93 64.7±2.54c 52.9±4.07 42.2±3.68d 38.7±2.66 27.1±3.19e

表3 不同營養(yǎng)干預(yù)NO、iNOS、TNF-α結(jié)果統(tǒng)計(jì)+s

表3 不同營養(yǎng)干預(yù)NO、iNOS、TNF-α結(jié)果統(tǒng)計(jì)+s

注：a表示與y2相比高度顯著性差異（P＜0.01），b表示與c2相比有高度顯著性差異（P＜0.01），c表示與c4相比有顯著性差異（P＜0.05）。

組別NO （umol /gprot n=6）iNOS （U/mgprot n=6）TNF-α（ng/L n=6）c2 y2 c3 y3 c4 y4 5.99±0.256 6.07±0.362 5.20±0.369 5.39±0.299 6.83±0.908 6.29±0.475 3.11±0.175 2.75±0.157a 2.61±0.362 2.76±0.159 3.23±0.363 3.07±0.304 112±3.68 106±2.82b 95.5±4.73 87.5±7.33 100±3.54 91.1±5.53c

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 ALT測(cè)定 采用紫外—乳酸脫氫酶法。

1.5.2 ALT含量測(cè)定 采用紫外—蘋果酸脫氫酶法。

1.5.3 NO測(cè)定 采用硝酸還原酶法。

1.5.4 iNOS測(cè)定 肝組織勻漿內(nèi)iNOS的計(jì)算公式為：肝組織中iNOS活性（U/ml）=（總NOS測(cè)定管OD值－空白管OD值）/呈色物納摩爾消光系數(shù)?反應(yīng)總體積/取樣量?1/（比色光鏡?反應(yīng)時(shí)間）/蛋白含量（mgprol/L）=（總NOS測(cè)定管OD值－空白管OD值）/（38.3?10-6）?（2.41+a?）/a?x1/（1?15）/ 蛋白含量（mgprol/L）。

1.5.5 小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫分析測(cè)定應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠TNF-α水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)比較，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，顯著性水平為P=0.05。所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠力竭情況

8組小鼠中運(yùn)動(dòng)組小鼠均完成了一次性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，整個(gè)過程中基本未出現(xiàn)拒絕游泳的現(xiàn)象。運(yùn)動(dòng)時(shí)間為63±3min。

2.2 血清生化指標(biāo)的變化

ALT和AST活性的增高是肝膽疾病的表征之一。本文通過運(yùn)動(dòng)前后ALT和AST活性來判斷運(yùn)動(dòng)損傷建模是否成功，如運(yùn)動(dòng)后活性大于運(yùn)動(dòng)前活性，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則說明建模成功。根據(jù)表c組與y組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果可以看出，運(yùn)動(dòng)后大于運(yùn)動(dòng)前，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小鼠急性肝損傷模型建模成功。將運(yùn)動(dòng)蒸餾水組與運(yùn)動(dòng)益生菌組以時(shí)間點(diǎn)為基準(zhǔn)對(duì)ALT和AST活性進(jìn)行比較，益生菌組活性低于蒸餾水組。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，如表2所示。將各時(shí)間組進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，其P值均小于0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為營養(yǎng)干預(yù)對(duì)小鼠一次性力竭運(yùn)動(dòng)所造成的肝損傷可能有一定的保護(hù)作用。

2.3 肝組織生化指標(biāo)的改變及討論

NO在體內(nèi)大量產(chǎn)生時(shí)會(huì)引起大量有毒代謝物的產(chǎn)生，致使肝臟損傷，是引起肝細(xì)胞凋亡的重要因素。故經(jīng)益生菌干預(yù)后小鼠組織內(nèi)NO含量能夠在一定程度上反映出益生菌在一次性大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)中保護(hù)肝臟的作用。表3將運(yùn)動(dòng)蒸餾水組與運(yùn)動(dòng)益生菌組以時(shí)間點(diǎn)為基準(zhǔn)進(jìn)行NO活性進(jìn)行比較，益生菌組小鼠組織中NO含量與蒸餾水組小鼠組織中NO含量無明顯差異。推測(cè)是由于取材后將樣品放入液氮保存進(jìn)而轉(zhuǎn)存至超低溫冰箱，并未使用新鮮樣品直接進(jìn)行測(cè)定，故以上因素可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定影響。NOS可以以左旋精氨為底物催化生成NO，所以iNOS的活性可以有效地反應(yīng)肝臟內(nèi)NO的情況。將運(yùn)動(dòng)蒸餾水組與運(yùn)動(dòng)益生菌組以時(shí)間點(diǎn)為基準(zhǔn)對(duì)iNOS活性進(jìn)行比較，如表3。y2組小鼠iNOS活性低于c2組，經(jīng)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)其顯著性低于0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但運(yùn)動(dòng)后12h組與運(yùn)動(dòng)后24h組NOS活性并沒有顯著性差異，推測(cè)是由于取材后將樣品放入液氮保存進(jìn)而轉(zhuǎn)存至超低溫冰箱，并未使用新鮮樣本直接進(jìn)行測(cè)定，以上因素可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定影響。TNF-a是內(nèi)毒素所致的急性肝損傷中的炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子。能激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起肝臟損傷，如表3。將運(yùn)動(dòng)蒸餾水組與運(yùn)動(dòng)益生菌組以時(shí)間點(diǎn)為基準(zhǔn)進(jìn)行TNF-α含量進(jìn)行比較，y2和y4組小鼠TNF-α含量均低于c2和c4組。經(jīng)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這證明益生菌能夠通過肝-腸軸作用到肝細(xì)胞內(nèi)，可能會(huì)對(duì)一次性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成的肝損傷進(jìn)行保護(hù)。

3 討 論

3.1 一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠肝臟的影響

在超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，機(jī)體處于缺氧狀態(tài)；體內(nèi)血液分布發(fā)生改變，血液由內(nèi)臟器官大量流向肌肉組織，以上兩種因素共同作用，導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生。

本次研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致小鼠肝臟損傷，其表現(xiàn)為血清中ALT、AST活性增高。通常，ALT在肝臟組織中活性最強(qiáng)，AST在心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞中有較強(qiáng)的酶活性。當(dāng)肝細(xì)胞受損，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞細(xì)胞膜完整性受到破壞甚至溶解，線粒體內(nèi)容物擴(kuò)散至組織和血清中，引起血清中轉(zhuǎn)氨酶幅度大幅上升。

3.2 益生菌對(duì)一次性力竭運(yùn)動(dòng)引起的小鼠肝損傷的保護(hù)作用

本研究中針對(duì)小鼠進(jìn)行了益生菌營養(yǎng)干預(yù)。結(jié)果顯示，補(bǔ)充益生菌的小鼠相較于蒸餾水組，血清中ALT和AST活性大幅下降，這證明肝細(xì)胞膜受到了一定的保護(hù)，在沒有補(bǔ)充益生菌的小鼠中，其細(xì)胞膜通透性大幅增加，致使小鼠血清中ALT、AST的活性有顯著性增高。而在補(bǔ)充益生菌的小鼠血清中，盡管其ALT、AST的活性也增高了，但是其增高顯著低于蒸餾水組，這說明益生菌的補(bǔ)充有益于保持肝細(xì)胞膜的完整性。

腸道黏膜屏障的完整性主要依靠腸上皮細(xì)胞維持，通過微絨毛等保證屏障結(jié)構(gòu)功能完整。TNF-α與肝損傷和腸粘膜損傷密切相關(guān)。當(dāng)腸粘膜通透性增高時(shí)，腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)生的毒素、細(xì)菌及一些大分子物質(zhì)可以穿過腸道屏障進(jìn)入血液或者腹腔，引起肝臟內(nèi)環(huán)境的改變。TNF-α是一種具有多態(tài)性的細(xì)胞因子，與炎癥發(fā)生、細(xì)胞凋亡、新陳代謝等相關(guān)。而這些生物活性和其重要的調(diào)節(jié)功能，與急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在急性肝損傷過程中，TNF-α含量較低時(shí)，可以抑制細(xì)胞的凋亡，而濃度過高時(shí)，加重?fù)p傷的惡化。在組織處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，iNOS即誘生型NOS被激活，持續(xù)大量的NO被合成、釋放，具有顯著的肝細(xì)胞毒作用。在研究中，運(yùn)動(dòng)益生菌組小鼠組織中NO的結(jié)果與運(yùn)動(dòng)蒸餾水組沒有明顯差異，這可能是由于未使用新鮮樣本進(jìn)行測(cè)試造成的。組織中iNOS在運(yùn)動(dòng)后3h，益生菌組要顯著低于蒸餾水組。由于NO不穩(wěn)定極易降解，樣本保存措施不當(dāng)，以至出現(xiàn)上述結(jié)果。

4 結(jié) 論

一次性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，小鼠血液中ALT，AST活性增高，證明小鼠發(fā)生急性肝損傷，小鼠血液中TNF-α含量增高，而益生菌營養(yǎng)干預(yù)可以使小鼠血液中TNF-α含量降低。推測(cè)益生菌通過改善腸粘膜通透性抑制細(xì)菌異位，減少了肝組織細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，從而達(dá)到保護(hù)肝臟的目的。