張春雷，靳立明，葉 昱，張 杰，朱 俊，高又文，廖 明，樊惠英

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

當(dāng)前，豬圓環(huán)病毒2 型(Porcine circovirus type 2，PCV 2)是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的病原之一［1］.該病毒與豬的多種疾病綜合征有關(guān)，特別是斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，還可導(dǎo)致豬呼吸道病綜合征(Por-cine respiratory disease complex，PRDC)、豬皮炎/腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNA)等相關(guān)疾?。?-4］.該病最早于1991年在加拿大發(fā)現(xiàn)，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀、進(jìn)行性消瘦、蒼白發(fā)熱及黃疸等.PCV2 主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，造成繼發(fā)感染，在豬群中感染率非常高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5-6］.

PCV2 基因組為單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA，基因組全長(zhǎng)1 767 或1 768 bp，共編碼11 個(gè)開放閱讀框架(Open reading frames，ORFs)，其中功能上以O(shè)RF1 和ORF2最為重要.ORF1 編碼與病毒DNA 滾環(huán)復(fù)制相關(guān)的蛋白(Rep)［7］;ORF2 編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)，構(gòu)成病毒的核衣殼，是病毒的主要免疫原性蛋白［8-9］，所以關(guān)于PCV2 基因工程疫苗和診斷試劑盒的研究，都主要集中在PCV2 Cap 蛋白上.

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曾利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system，BEVS)表達(dá)PCV2 Cap 蛋白，但重組Cap 蛋白在Sf9 昆蟲細(xì)胞中以包涵體形式存在，而非其天然活性狀態(tài)，不利于其抗原表位的展示，導(dǎo)致該蛋白的免疫原性不強(qiáng)，也不利于該蛋白的后期純化.因此，本研究擬通過引入EGT 分泌型信號(hào)肽取代ORF2 原有核定位信號(hào)肽(NLS)以達(dá)到Cap 蛋白分泌出細(xì)胞的目的，并在ORF2 C 端融合6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽以便于后期的純化，從而產(chǎn)生具有天然結(jié)構(gòu)和更高免疫活性的重組Cap 蛋白，為PCV2 基因工程疫苗的研究提供新的選擇.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌種和細(xì)胞 PCV2 毒株、Sf9 昆蟲細(xì)胞、大腸埃希菌DH5α、DH10Bac 菌株均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，pFast-BacTMDual 為Invitrogen 公司產(chǎn)品.

1.1.2 主要試劑ExTMTaqDNA 多聚酶、dNTP 為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，T4DNA 連接酶和各種限制性內(nèi)切酶等工具酶均為NEB 公司產(chǎn)品，DNA 凝膠純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(Grace)和LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑為美國(guó)Invitrogen 公司產(chǎn)品，胎牛血清為奧地利PAA 公司產(chǎn)品.抗PCV2 的陽(yáng)性血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存，F(xiàn)ITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 為Sigma公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 EGT 信號(hào)肽基因的擴(kuò)增和鑒定 根據(jù)EGT基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR 擴(kuò)增EGT 信號(hào)肽基因.P1:5'-ACGCGTCGACATGACTATTCTCTGCTGGCTTGCACTGCTGTCTACGCTTACTGCT-3'，P2:5'-GTGTTGAAGATGCCATTGGCCGCATTTACAGCAGTAAGCGTAGACAGCAG-3'，P1 上游下劃線部分為保護(hù)性堿基，斜線部分為SalⅠ酶切位點(diǎn)，ATG 為起始密碼子.引物P1 和P2 之間有21 個(gè)堿基互補(bǔ)，P1、P2 互為模板，用ExTMTaqDNA 多聚酶擴(kuò)增EGT 信號(hào)肽基因，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為84 bp.PCR 循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸40 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min.PCR 產(chǎn)物送上海英俊生物公司進(jìn)行序列測(cè)定.

1.2.2 去除核定位信號(hào)肽ORF2(dORF2)基因的擴(kuò)增和鑒定 根據(jù)PCV2 ORF2 序列設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物.P3:5'-AATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGC-3'，P4:5'-TGCTAAGCTTTTAGTGGTGATGATGGTGGTGAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3'.其中，引物P3 與EGT 信號(hào)肽基因有17 個(gè)堿基的互補(bǔ)，P4中下劃線部分為保護(hù)性堿基，斜線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)，波浪線部分為6 個(gè)組氨酸編碼序列.以克隆載體pMD18-T PCV2 為模板，用ExTMTaqDNA 多聚酶擴(kuò)增dORF2 基因，PCR 循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為607 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英俊生物公司進(jìn)行序列測(cè)定.

1.2.3 EGT 信號(hào)肽序列和dORF2 序列的PCR 融合PCR 反應(yīng)體系為50 μL，取經(jīng)純化的EGT 信號(hào)肽和dORF2 產(chǎn)物各1.5 μL，引物P1 和P4(20 pmol/L)各1 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，10× Ex TaqTMBuffer 5 μL，Ex TaqTMDNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，去離子水35 μL.用ExTMTaqDNA 多聚酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為674 bp，PCR 產(chǎn)物前端帶有salⅠ酶切位點(diǎn)，后端帶有HindⅢ酶切位點(diǎn)，并有6 個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽，命名為EGTdORF2，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英俊生物公司進(jìn)行序列測(cè)定.

1.2.4 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac-EGT-dORF2 的構(gòu)建與鑒定 將擴(kuò)增的片段EGT-dORF2 進(jìn)行膠回收純化，然后用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切，連接到經(jīng)同樣酶切消化的pFastBacTMDual 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行含氨芐抗性的平板篩選，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行搖菌擴(kuò)增，小量提取質(zhì)粒，用SalⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切，篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-EGT-dORF2.進(jìn)行序列測(cè)定以驗(yàn)證插入序列的正確性.

1.2.5 重組穿梭載體Bacmid-EGT-dORF2 的獲得將重組質(zhì)粒pFastBac-EGT-dORF2 轉(zhuǎn)化DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，用三抗平板(Kan、Gen 和Tet)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，純化白色陽(yáng)性菌落，提取Bacmid 質(zhì)粒，用M13通用引物鑒定穿梭質(zhì)粒Bacmid-EGT-dORF2.

1.2.6 重組桿狀病毒Bv-EGT-dORF2 的獲得 提取純化Bacmid-EGT-dORF2，利用LipofectamineTM2000將Bacmid-EGT-dORF2 轉(zhuǎn)染Sf9 昆蟲細(xì)胞，于27℃條件下培養(yǎng)，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收集培養(yǎng)液上清液即獲得了重組桿狀病毒Bv-EGT-dORF2，并利用昆蟲細(xì)胞擴(kuò)增種毒.

1.2.7 間接免疫熒光檢測(cè)Cap 蛋白的表達(dá) 用24孔板培養(yǎng)Sf9 細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，接種重組桿狀病毒Bv-EGT-dORF2，27℃培養(yǎng)72 h，至細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，棄培養(yǎng)上清液，收獲細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌3次，干燥后用預(yù)冷的丙酮-乙醇(體積比3∶2)固定液于-20℃條件固定15 min，以1∶200 稀釋的鼠抗PCV2 抗體為一抗，1∶100 稀釋的FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 為二抗，熒光顯微鏡觀察結(jié)果.

1.2.8 Western-blot 鑒定Cap 蛋白的表達(dá) 收集感染Bv-EGT-dORF2 的Sf9 昆蟲細(xì)胞，用適量PBS 重懸，經(jīng)適當(dāng)處理后，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)移至NC 膜，用0.05 g/mL 脫脂奶粉封閉2 h，PBST 洗滌后，一抗孵育過夜，再用1∶10 000 稀釋的FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗孵育1 h，經(jīng)Odyssey 雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描，并觀察結(jié)果.

2 結(jié)果

2.1 EGT 信號(hào)肽和dORF2 基因的連接結(jié)果

將含有SalⅠ酶切位點(diǎn)的編碼EGT 信號(hào)肽基因片段和含有Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的dORF2 片段進(jìn)行PCR 融合擴(kuò)增，其產(chǎn)物用0.01 g/mL 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，出現(xiàn)674 bp 條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)，測(cè)序結(jié)果表明無(wú)堿基突變.

2.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-EGT-dORF2 的構(gòu)建

對(duì)重組質(zhì)粒pFastBac-EGT-dORF2 分別進(jìn)行salⅠ和HindⅢ單酶切和雙酶切鑒定，單酶切消化后產(chǎn)生大小約為5 200 bp 片段，雙酶切后產(chǎn)生4 500 和670 bp 的2 個(gè)片段，與預(yù)期大小一致(圖2).并對(duì)pFastBac-EGT-dORF2 進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)無(wú)堿基突變.

2.3 重組穿梭載體Bacmid-EGT-dORF2 的PCR鑒定

將重組穿梭載體 Bacmid-EGT-dORF2 轉(zhuǎn)化DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白斑進(jìn)行菌液擴(kuò)增，提取質(zhì)粒用M13 引物進(jìn)行PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在3 500 bp 處可見特異性條帶，證明已成功獲得重組Bacmid-EGTdORF2(圖3).

圖1 EGT-dORF2 融合產(chǎn)物的PCR 鑒定Fig.1 Identification of the fused EGT-dORF2 by PCR

圖2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-EGT-dORF2 的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant vector pFastBac-EGT-dORF2

圖3 重組穿梭載體Bacmid-EGT-dORF2 的PCR 鑒定Fig.3 Identification of recombinant transfer vector Bacmid-EGTdORF2 by PCR

2.4 重組桿狀病毒Bv-EGT-dORF2 的鑒定

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將提取的重組穿梭載體Bacmid-EGT-dORF2 轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞，于27℃培養(yǎng)，72 h 出現(xiàn)細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞變大、變圓、折光率增強(qiáng)、膨脹等(圖4).

圖4 重組穿梭載體Bacmid-EGT-dORF2 轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞Fig.4 Transfeccted insect cells by recombinant transfer vector Bacmid-EGT-dORF2

2.5 間接免疫熒光鑒定Cap 蛋白的表達(dá)

重組桿狀病毒感染Sf9 細(xì)胞后，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn).結(jié)果顯示，重組桿狀病毒Bv-EGT-dORF2 感染Sf9 細(xì)胞后，能夠與抗PCV2 血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，發(fā)出特異性的免疫熒光，并且熒光信號(hào)主要分布在細(xì)胞膜上(圖A)，而野毒感染組未出現(xiàn)任何熒光(圖B)，表明重組桿狀病毒成功表達(dá)Cap 蛋白(圖5).

圖5 重組桿狀病毒Bv-EGT-dORF2 的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)Fig.5 Indirect immunofluorescence of the recombinant baculovirus Bv-EGT-dORF2

2.6 Western-blot 鑒定Cap 蛋白的表達(dá)

Sf9 昆蟲細(xì)胞感染Bv-EGT-dORF2 后72 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行Western-blot 鑒定，在相對(duì)分子質(zhì)量為28 000處出現(xiàn)特異性條帶，而野生桿狀病毒對(duì)照組則未出現(xiàn)條帶.表明重組桿狀病毒能夠在Sf9 細(xì)胞表達(dá)具有生物活性的Cap 蛋白(圖6).

圖6 重組桿狀病毒Bv-EGT-dORF2 的Western-blot 鑒定Fig.6 Identification of recombinant baculovirus Bv-EGT-dORF2 by Western-blot

3 討論

Cap 蛋白為PCV2 的核衣殼蛋白，是該病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)也是病毒主要的免疫原性蛋白，所以關(guān)于PCV2 診斷和基因工程疫苗的研究，都集中在Cap 蛋白上［8-9］.Cap 蛋白的表達(dá)作為一個(gè)研究的熱點(diǎn)，已在不同系統(tǒng)中獲得表達(dá).陳春麗等［10］利用pCold-SUMO 原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了Cap 蛋白的可溶性高效表達(dá).宋云峰等［11］利用偽狂犬病毒作為載體，表達(dá)了Cap 蛋白.歐陽(yáng)素貞等［12］利用重組腺病毒載體成功表達(dá)了Cap 蛋白.樊惠英［13］利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PCV2 Cap 蛋白，并對(duì)所表達(dá)的重組Cap 的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究.王彥彬等［14］、Yamaji 等［15］和Golden 等［16］通過引入一些信號(hào)肽實(shí)現(xiàn)目的蛋白的分泌表達(dá).

Cap 蛋白的N 端65aa～87aa、113aa～147aa、157aa～183aa 區(qū)域?yàn)椴《镜闹饕乖稽c(diǎn)［17-18］，其中N 端69～83aa 和117aa～131aa 抗原位點(diǎn)是型特異性的PCV2 抗原位點(diǎn)，但由于ORF2 基因編碼的N端41 個(gè)氨基酸為核定位信號(hào)肽［19］，不包含主要的抗原區(qū)域，但使得Cap 蛋白定位于細(xì)胞核.不利于其抗原表位的展示，導(dǎo)致該蛋白的免疫原性不強(qiáng)，也不利于該蛋白的后期純化.因此，本研究通過引入EGT 分泌型信號(hào)肽取代ORF2 原有核定位信號(hào)肽(NLS)，構(gòu)建了介導(dǎo)分泌表達(dá)PCV2 Cap 的重組桿狀病毒.

間接免疫熒光試驗(yàn)表明，被重組桿狀病毒感染的Sf9 昆蟲細(xì)胞顯示很強(qiáng)的熒光信號(hào)，并且其熒光主要分布在細(xì)胞膜上，表明重組蛋白是以分泌型的形式進(jìn)行表達(dá).進(jìn)一步對(duì)重組桿狀病毒Bv-EGT-dORF2進(jìn)行Western-blot 鑒定，在相對(duì)分子質(zhì)量28 000 處出現(xiàn)特異性條帶，而野生桿狀病毒對(duì)照組則未出現(xiàn)條帶，表明重組桿狀病毒能夠表達(dá)具有生物活性的Cap蛋白.但是在Sf9 培養(yǎng)上清液中未檢測(cè)到Cap 蛋白的表達(dá)，經(jīng)過分析，其原因可能是由于EGT 信號(hào)肽為外源信號(hào)肽，而非來(lái)自Sf9 細(xì)胞，因此，表達(dá)的Cap 蛋白雖然可以通過EGT 信號(hào)肽引導(dǎo)分泌到細(xì)胞外，但卻不能被Sf9 細(xì)胞所識(shí)別，不能被正確剪切掉，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的Cap 蛋白很少，從而檢測(cè)不到該蛋白的表達(dá).這也與王彥彬等［14］的研究結(jié)果一致.

同時(shí)，本研究在Cap 蛋白的C 端融合進(jìn)去6 個(gè)His 標(biāo)簽，方便目的蛋白的后期純化過程［20］.并對(duì)病毒感染后最佳收毒時(shí)間進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，結(jié)果表明，感染后72 h 時(shí)細(xì)胞病變最為明顯，間接免疫熒光最亮，表明此時(shí)蛋白的表達(dá)量最高，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞碎片，熒光反而會(huì)減弱.

本研究通過引入EGT 分泌型信號(hào)肽，構(gòu)建了介導(dǎo)分泌表達(dá)Cap 蛋白的重組桿狀病毒，成功實(shí)現(xiàn)了PCV2 Cap 蛋白的表達(dá)，但未有效地分泌到上清液中，因此，我們下一步的工作將繼續(xù)試用來(lái)源于Sf9細(xì)胞或者能被Sf9 細(xì)胞所識(shí)別的信號(hào)肽，來(lái)提高細(xì)胞培養(yǎng)上清液中目的蛋白的表達(dá)量.

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