周竹君，高基民

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

肺癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是我國(guó)目前的第一大癌[1-3]，由于缺乏早期的診斷和系統(tǒng)的治療方法，肺癌病人的預(yù)后很差。香煙煙霧中含有60多種致癌物，其中苯并芘(benzoapyrene，B[a]P)是重要的完全致肺癌多環(huán)芳烴類(lèi)化合物[4-5]。苯并芘在環(huán)境中分布廣泛，存在于煤炭、石油等礦石燃料不完全燃燒產(chǎn)生的煙氣和香煙煙霧中。人類(lèi)每天通過(guò)吸煙或者被污染的空氣、食物和水等途徑，攝入一定量的苯并芘，苯并芘通常在動(dòng)物模型(如小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠)中誘發(fā)肺鱗狀上皮細(xì)胞癌[6]。慢性炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，主要包括促進(jìn)腫瘤惡性轉(zhuǎn)變、腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲、腫瘤組織血管的生成[7]。近年來(lái)，關(guān)于腫瘤免疫方向的研究表明，在慢性炎癥向癌癥轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，免疫微環(huán)境發(fā)生了一系列的動(dòng)態(tài)變化。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生許多免疫抑制性分子，促進(jìn)免疫微環(huán)境向免疫抑制性方向發(fā)展。明確肺癌發(fā)生的分子機(jī)制，有望通過(guò)改善肺慢性炎癥組織內(nèi)免疫抑制微環(huán)境，為肺癌的早期預(yù)防和免疫治療提供新的策略。體內(nèi)動(dòng)物模型的建立可以幫助研究者開(kāi)展疾病相關(guān)病理機(jī)制和早期治療靶點(diǎn)的研究，制備出能夠體現(xiàn)人類(lèi)吸煙引起的肺慢性炎癥的病理特征的動(dòng)物模型十分必要[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)雄性昆明小鼠，購(gòu)自上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，引進(jìn)飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，6～8周齡，體重(60±5)g。

苯并芘購(gòu)自中國(guó)阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；玉米油購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；FITC標(biāo)記的CD3，APC標(biāo)記的CD8抗體購(gòu)自美國(guó) BioLegend公司。

1.2 方法

將60只 SPF級(jí)昆明種小鼠，置于室溫25 ℃，相對(duì)濕度55%，12 h明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水。適應(yīng)1周后，將小鼠隨機(jī)分成2組，經(jīng)右側(cè)胸壁穿刺肺內(nèi)注射，對(duì)照組給予50 μL玉米油，處理組給予50 μL苯并芘-玉米油溶液(苯并芘濃度為20 mg·mL-1),每周處理1次，共4次。每日觀察小鼠飲食、排便、毛色、精神和活動(dòng)狀況。分別在處理后30、90、180 d處死小鼠，稱(chēng)重并采樣以供檢測(cè)。

1.3 樣品測(cè)定

1.3.1 小鼠肺組織形態(tài)的觀察

將小鼠肺組織取出，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)變化，比較炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度及腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.3.2 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況

將小鼠肺組織和脾臟取出，研磨消化制成單細(xì)胞懸液，200目尼龍膜過(guò)濾，Anti-CD3-FITC、Anti-CD8-APC流式抗體染色，4 ℃避光孵育30 min，IMDM培養(yǎng)基清洗3遍，上機(jī)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Prism 5.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，ns表示差異不顯著(P>0.05)，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肺組織形態(tài)

小鼠右側(cè)肺組織切片見(jiàn)圖1。如圖所示，處理組小鼠肺組織出現(xiàn)了明顯的炎癥反應(yīng)和病理改變，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)和病理改變逐漸明顯。苯并芘暴露180 d后，小鼠肺組織出現(xiàn)大量異型性細(xì)胞，肺組織的正常生理結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)肺癌特征。對(duì)照組小鼠肺泡腔、毛細(xì)血管及終末細(xì)支氣管均無(wú)明顯的結(jié)構(gòu)異常。

2.2 小鼠脾臟質(zhì)量的改變

不同處理對(duì)小鼠脾臟質(zhì)量的影響見(jiàn)圖2。如圖所示，隨著苯并芘暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組小鼠脾臟出現(xiàn)明顯腫大。

2.3 小鼠肺組織中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況

CD8+T細(xì)胞是由原始T細(xì)胞分化而來(lái)的一個(gè)亞群，是機(jī)體細(xì)胞免疫的重要效應(yīng)分子。CD8+T細(xì)胞識(shí)別內(nèi)源性抗原肽+MHC I類(lèi)分子復(fù)合物，活化之后的效應(yīng)分子具有強(qiáng)大的殺傷功能，能夠分泌某些活化型細(xì)胞因子如IFN-γ、顆粒酶和穿孔素等來(lái)應(yīng)答內(nèi)源性抗原和殺傷腫瘤細(xì)胞。不同處理小鼠肺組織CD8+T細(xì)胞表達(dá)的代表性流式細(xì)胞圖見(jiàn)圖3。

a，玉米油暴露30 d；b，玉米油暴露90 d；c，玉米油暴露180 d；d，苯并芘暴露30 d；e，苯并芘暴露90 d；f，苯并芘暴露180 d

圖2 不同處理對(duì)小鼠脾臟質(zhì)量的影響

a，玉米油暴露30 d；b，玉米油暴露90 d；c，玉米油暴露180 d；d，苯并芘暴露30 d；e，苯并芘暴露90 d；f，苯并芘暴露180 d

不同處理對(duì)小鼠肺組織CD8+T細(xì)胞水平的影響見(jiàn)圖4。小鼠在苯并芘暴露30 d和90 d時(shí),肺組織CD8+T細(xì)胞處于上升的趨勢(shì)，表明炎癥反應(yīng)明顯。當(dāng)苯并芘暴露180 d時(shí)，小鼠肺組織CD8+T細(xì)胞顯著下降，表明小鼠體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞處于耗竭狀態(tài)。

2.4 小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況

不同處理小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞表達(dá)的代表性流式細(xì)胞圖見(jiàn)圖5。不同處理對(duì)小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞水平的影響見(jiàn)圖6。小鼠在苯并芘暴露90 d時(shí),脾臟中CD8+T細(xì)胞顯著增加。當(dāng)苯并芘暴露180 d時(shí)，脾臟中的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞顯著減少，處于耗竭狀態(tài)。

圖4 不同處理小鼠肺組織CD8+T細(xì)胞水平

a，玉米油暴露30 d；b，玉米油暴露90 d；c，玉米油暴露180 d；d，苯并芘暴露30 d；e，苯并芘暴露90 d；f，苯并芘暴露180 d

圖6 不同處理小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞水平

3 討論

目前，因環(huán)境污染及吸煙等因素導(dǎo)致肺癌的發(fā)病呈逐年上升的態(tài)勢(shì)，依據(jù)世界衛(wèi)生組織癌癥研究中心(IARC)的調(diào)查報(bào)告，肺癌已經(jīng)成為全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年因肺癌死亡的人數(shù)約140萬(wàn)。研究表明，肺癌與吸煙呈正相關(guān)，香煙煙霧中含有60余種致癌物，其中苯并芘(benzoapyrene，B[a]P)是最重要的完全致肺癌化合物[4-5]。苯并芘是多環(huán)芳烴類(lèi)化合物的一種，具有較強(qiáng)的致癌作用，在環(huán)境中分布廣泛，存在于煤炭、石油等礦石燃料不完全燃燒產(chǎn)生的煙氣及其香煙煙霧等。苯并芘能通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)肺癌，常用小鼠來(lái)建立肺癌動(dòng)物模型，便于直接觀察肺慢性炎癥至肺癌的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程以及肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程的形態(tài)變化。

苯并芘易誘導(dǎo)動(dòng)物模型(如小鼠，大鼠和倉(cāng)鼠)發(fā)生肺鱗狀上皮細(xì)胞癌[6-8]，這些腫瘤在形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)上與人類(lèi)相似。在苯并芘給藥后相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)， 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠自發(fā)長(zhǎng)出大量的腫瘤并產(chǎn)生強(qiáng)烈的肺腫瘤反應(yīng)[9-10]，且與人肺癌有許多相似的遺傳、生物化學(xué)和組織病理學(xué)特征，因此小鼠已廣泛用于苯并芘的致癌作用以及干預(yù)策略的效應(yīng)研究[11]。值得一提的是，苯并芘誘導(dǎo)肺癌有多種途徑，包括口服、皮下注射、氣管內(nèi)灌注、吸入、腹腔注射及胸腔穿刺給藥等[12-16]，通過(guò)飲食中添加一定劑量的苯并芘可以誘導(dǎo)小鼠肺部腫瘤，但是苯并芘劑量受飲食量的影響，并且易誘發(fā)肝腫瘤和胃腫瘤。也有報(bào)道通過(guò)皮下注射和腹腔注射苯并芘的方法來(lái)誘導(dǎo)肺部腫瘤，但是會(huì)出現(xiàn)腫瘤的多樣性，不僅小鼠肺部會(huì)出現(xiàn)腫瘤，而且局部注射位置以及小鼠肝臟、胃腸道、食管等也會(huì)出現(xiàn)腫瘤。霧化吸入的方法是最接近吸煙的動(dòng)物模型，但是成瘤率低，并且會(huì)造成空氣污染以及有損實(shí)驗(yàn)操作者的健康。通用的造模方法是氣管內(nèi)灌注，但是對(duì)操作者要求較高。綜合考慮，采用經(jīng)胸腔穿刺肺內(nèi)直接注射法來(lái)構(gòu)建小鼠肺癌模型，這種方法創(chuàng)傷小，不易造成氣胸，小鼠恢復(fù)快，并且定位準(zhǔn)確，用無(wú)致癌作用的玉米油作為溶介可防止揮發(fā)。

昆明小鼠腫瘤自發(fā)率低，抗病力和適應(yīng)力很強(qiáng)，繁殖率、成活率高，并且價(jià)格便宜。采用昆明小鼠作為實(shí)驗(yàn)小鼠，經(jīng)胸腔穿刺肺內(nèi)直接注射苯并芘來(lái)構(gòu)建昆明小鼠肺癌模型，為后續(xù)研究吸煙及煙霧誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生的分子機(jī)制提供了良好的模型基礎(chǔ)。