徐鑫鑫 ，林 蘭 ，王旭東 ，張 艷 ，李小華

（1南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇226001；2南通市腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科）

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病人數(shù)逐年增長(zhǎng)。由于患者早期缺乏典型的臨床特征，待發(fā)現(xiàn)時(shí)大部分處于中晚期，因此需尋找有效的肺癌早期診斷生物學(xué)標(biāo)志物。microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性、非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核生物中，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-107在許多腫瘤中有異常表達(dá)，如肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肺癌[1－2]等。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-107在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中表達(dá)量降低，且與肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有關(guān)，并能通過(guò)靶向結(jié)合BDNF調(diào)控PI3K/AKT途徑[3]。本實(shí)驗(yàn)中收集52例肺癌患者癌組織及癌旁組織，采用RT-PCR對(duì)miR-107的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)、分析，探討miR-107表達(dá)水平在肺癌早期診斷方面潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 52例肺癌組織及相應(yīng)癌旁組織（距離病灶>5 cm）均取自南通市腫瘤醫(yī)院標(biāo)本庫(kù)，患者術(shù)前、術(shù)中均未接受放療、化療及免疫治療。病理分期采用國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)（IASLC）第七版 TNM分期。患者肺癌組織標(biāo)本及臨床資料的收集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。所有標(biāo)本均在離體后30 min內(nèi)經(jīng)無(wú)菌無(wú)酶水沖洗后置于凍存管中，液氮迅速冷凍后放-80℃冰箱中保存?；颊咭话阗Y料見(jiàn)表1。

1.2 試劑及儀器 TRIZOL試劑（美國(guó)ambion公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司），RT-PCR試劑盒（德國(guó) Roche公司），miR-107引物 BulgeloopTM miRNA qRT-PCR Primer Sets（one RT primer and a pair of qRCR primers for each set）（廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)），7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），4℃離心機(jī)（日本Hitachi公司），HB-1000分子雜交箱（美國(guó)UVP公司），微量核酸蛋白分析儀（德國(guó)IMPLEN公司），-80℃冰箱（日本SANYO公司）。

1.3 RT-PCR檢測(cè)miR-107表達(dá) 提取肺癌組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，U6為內(nèi)參，采用SYBR Green法檢測(cè)miR-107的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)反應(yīng)孔為20 μL體系，包括2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.8 μL miRNA Taqman 引物、10 μL Mix體系和6.4 μL DEPC水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火和72℃延伸各30 s，共35個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct值表示miR-107的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Graphpad Prism 5.0軟件制作圖表。肺癌患者組織及癌旁組織中miR-107表達(dá)不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，不同臨床病理特征肺癌患者組織中miR-107表達(dá)的比較采用χ2檢驗(yàn)。建立ROC曲線評(píng)價(jià)miR-107表達(dá)水平對(duì)肺癌的診斷價(jià)值。以P<0.05或P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-107表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系 肺癌組織中miR-107表達(dá)下調(diào)42例，表達(dá)上調(diào)10例。miR-107在肺癌組織中的表達(dá)僅與性別和TNM分期有關(guān)（P<0.05），而與年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤大小、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 52例肺癌患者miR-107表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 肺癌組織中miR-107的表達(dá) 肺癌組織中miR-107 的表達(dá)量為 3.063（1.715，5.658），癌旁組織中 miR-107 的表達(dá)量為 10.26（4.007，21.33），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果提示，肺癌組織中miR-107的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織。見(jiàn)圖1。

2.3 miR-107表達(dá)的診斷價(jià)值 經(jīng)受試者工作特征（ROC）曲線分析，ROC 曲線下面積（Az）為 0.736（95%CI：0.639～0.833），最佳截?cái)嘀禐?4.4649，miR-107診斷肺癌的靈敏度和特異度均為71.2%。見(jiàn)圖2。

圖1 miR-107在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 miR-107表達(dá)診斷肺癌的ROC曲線圖

3 討 論

目前，我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后較差，這使得肺癌的早期診斷顯得尤為重要。miRNA是一類長(zhǎng)度為18～22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，能調(diào)控基因功能的表達(dá)。迄今為止，發(fā)現(xiàn)的miRNA已經(jīng)超過(guò)一千多種，多數(shù)證明與腫瘤密切相關(guān)，且不同種類的miRNA在不同腫瘤或相同的腫瘤中發(fā)揮作用不同。miRNA既可作為促癌分子，也可作為抑癌分子。近年來(lái)，miRNA在疾病診斷中的價(jià)值受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)并比較肺癌患者組織及癌旁組織中miR-107的表達(dá)情況，繪制ROC曲線，探討miR-107表達(dá)水平在肺癌早期診斷方面潛在的應(yīng)用價(jià)值。

miR-107是miRNA-15/107家族中的一員，只有一種成熟序列。miR-107基因序列高度保守，位于泛酰酸激酶（pantothenate kinase，PANK）家族中PANK1和PANK5的內(nèi)含子區(qū)域，幾乎人體所有組織均有表達(dá)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，miR-107與多種腫瘤發(fā)病及預(yù)后有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚不清楚。miR-107既能促腫瘤，又能抑制腫瘤的發(fā)生。Cheng等[4]研究認(rèn)為，miR-107在胃癌細(xì)胞系的表達(dá)明顯高于胃上皮細(xì)胞系，加入miR-107抑制劑后能顯著降低胃癌GC細(xì)胞的增殖及克隆形成能力。同樣，Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)，miR-107在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系（HepG2）中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常人肝細(xì)胞系（L02），miR-107能通過(guò)靶向結(jié)合Axin2促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。相反，Li等[6]采用qRT-PCR檢測(cè)了30例乳腺癌組織和癌旁組織，結(jié)果表明，miR-107在乳腺癌組織中低表達(dá)，并可通過(guò)直接靶向結(jié)合CDK8，抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞周期。Song等[7]也認(rèn)為，miR-107在腎臟細(xì)胞癌和細(xì)胞系中表達(dá)量均降低，過(guò)表達(dá)miR-107能顯著誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞周期阻滯，從而延緩腫瘤的生長(zhǎng)。此外，miR-107還與腫瘤耐藥有關(guān)，Lu等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-107能通過(guò)作用于抗凋亡因子Bcl-w促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性。

本研究采用RT-PCR檢測(cè)miR-107在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果提示肺癌組織中miR-107表達(dá)水平明顯低于癌旁組織（P<0.01）。這與Xia等[3]的結(jié)果一致。肺癌患者中miR-107表達(dá)僅與性別和TNM分期有關(guān)（P<0.05），而與年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤大小、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05），考慮到收集的標(biāo)本中男性患者居多，可能會(huì)對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)造成影響。通過(guò)ROC曲線分析顯示，miR-107對(duì)診斷的靈敏度和特異度均為71.2%，這說(shuō)明miR-107對(duì)肺癌具有較高的診斷效能，基本可作為肺癌早期診斷的分子標(biāo)志物。但由于結(jié)果偏低，miR-107不能單獨(dú)作為診斷標(biāo)志物，需要與其他肺癌分子指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)才有意義。同時(shí)，由于樣本量偏少，結(jié)果會(huì)產(chǎn)生偏倚，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪追蹤，以全面評(píng)估m(xù)iR-107對(duì)肺癌的診斷價(jià)值，為肺癌的早期診斷提供強(qiáng)有力的依據(jù)。另外，52例肺癌患者中僅有36例獲得定期隨訪，隨訪1～5年。其中死亡7例（19.4%），miR-107下調(diào)的患者中死亡6例（20.7%），miR-107上調(diào)的患者中死亡1例（14.3%），提示低表達(dá)miR-107的患者預(yù)后相對(duì)較差。但由于有些標(biāo)本缺乏具體的死亡日期，且追蹤不到位，不能繪制出生存曲線，因此說(shuō)服力還不夠，后期實(shí)驗(yàn)中會(huì)加以完善。

綜上，miR-107在肺癌組織中表達(dá)量下調(diào)，且對(duì)肺癌具有較高的診斷效能，這預(yù)示著miR-107可能成為肺癌新的治療的靶點(diǎn)，有望提高肺癌患者的生存率。