軒華強(qiáng) 朱方平 張 偉

（山東省聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，聊城252000）

萬象（Haworthia maughanii）是百合科瓦葦屬珍稀名種，又名象腳草、毛漢十二卷。萬象株高4～8cm，無莖，有粗壯的肉質(zhì)根，葉肉質(zhì)圓筒狀，成松散蓮座狀排列，葉頂端截形，大多數(shù)呈圓形，“窗”半透明，位于葉頂端的截面處，“窗”面布有白色條紋。萬象株型奇特，有很好的觀賞性[1]。雪國萬象是由日本育種家通過雜交改良繁殖出的萬象品種，其特征是大窗和發(fā)散狀的白紋，具有很高的觀賞價(jià)值。

因萬象自交不親和，利用種子繁殖比較困難。常規(guī)繁殖方法有分株、葉插，但繁殖速度慢，而且對母體的損傷比較大，小苗的成活率也不高[2]，年繁殖率只有1∶3左右，這使得種苗稀缺，另外由于分株、葉插獲得的小苗生長較為緩慢，致使供求失衡[3]，行業(yè)發(fā)展受到限制。采用組織培養(yǎng)的方式能夠快速獲得大量優(yōu)質(zhì)種苗，而且能夠保持品種純度，增加市場競爭力。關(guān)于萬象組培國內(nèi)外已有不少報(bào)道，但是大都是用花梗作為外植體進(jìn)行組培，用雪國萬象葉片作為外植體進(jìn)行組培的尚未見報(bào)道。

本研究通過對雪國萬象的葉片組織培養(yǎng)，尋找最適宜的培養(yǎng)基及各激素水平，以期為部分多肉植物的工廠化生產(chǎn)育苗與品種改良提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 雪國萬象取自山東省聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物工程中心一號溫室，取長勢良好的健康葉片為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 將洗滌處理好的葉片在超凈臺上先用75%的酒精快速浸泡30s，用無菌水洗滌2次，再用加有2滴吐溫-80的升汞處理8min。然后用無菌水洗滌5次，每次洗滌時(shí)間控制在3～4min。消毒后，用消毒鑷子和刀片將葉片切成長1cm左右的小塊，接種到不同激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo) 將不同濃度的NAA（萘乙酸）、6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）組合與不同濃度的6-BA、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）組合添加于MS基本培養(yǎng)基（MS+3.0%蔗糖+0.55%瓊脂，pH5.86）中進(jìn)行試驗(yàn)。NAA設(shè)置3個(gè)濃度，分別是0.10mg/L、0.20mg/L、0.30mg/L；6-BA 設(shè)置 3個(gè)濃度，分別是 1.50mg/L、2.00mg/L、2.50mg/L；2，4-D 設(shè)置3個(gè)濃度，分別是0.20mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L。

1.2.3 愈傷組織繼代培養(yǎng) 將不同濃度的NAA、6-BA組合添加于MS基本培養(yǎng)基（MS+3.0%蔗糖+0.55%瓊脂，pH5.86）中進(jìn)行試驗(yàn)。NAA設(shè)置4個(gè)濃度，分別是0.05mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L、0.20mg/L；6-BA設(shè)置4個(gè)濃度，分別是0.50mg/L、1.00mg/L、1.50mg/L、2.00mg/L。

1.2.4 愈傷組織分化 愈傷組織中顏色較綠的部位增殖能力較強(qiáng)[4]，在愈傷組織繼代培養(yǎng)中可得到大量愈傷組織，將其綠色較深部位切成小塊，接種到誘導(dǎo)不定芽分化的培養(yǎng)基中。分化培養(yǎng)基中添加NAA和6-BA。NAA設(shè)置3個(gè)濃度，分別是0.05mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L；6-BA設(shè)置3個(gè)濃度，分別是0.50mg/L、1.00mg/L、1.50 mg/L。

1.2.5 生根培養(yǎng)基篩選 當(dāng)苗長到1.5～2.0cm時(shí)，將苗移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根[5]。本試驗(yàn)研究不同濃度NAA和IBA（吲哚丁酸）2種生長素對雪國萬象組培苗生根的影響。分別將不同濃度的NAA和IBA添加于1/2 MS基本培養(yǎng)基（1/2 MS+3.0%蔗糖+0.55%瓊脂，pH5.86）中進(jìn)行試驗(yàn)，NAA和IBA均設(shè)置7個(gè)濃度，分別是0.10mg/L、0.20mg/L、0.30mg/L、0.40mg/L、0.50mg/L、0.60mg/L、0.70mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對葉片愈傷組織的誘導(dǎo)的影響在葉片誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中接種滅菌后的葉片，最初葉片會有一定程度的生長，約10d后葉片開始膨大，25d后會有黃綠色的顆粒狀愈傷組織在葉片的傷口或者邊緣處產(chǎn)生。之后，愈傷組織不斷增加，逐漸覆蓋整個(gè)葉片，30d后統(tǒng)計(jì)葉片愈傷組織的誘導(dǎo)情況，結(jié)果見表1。

表1 不同濃度NAA、6-BA組合與6-BA、2，4-D組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

通過表1可以看出，當(dāng)NAA和6-BA以不同濃度組合時(shí)，葉片均能在9種培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷組織在生長情況和誘導(dǎo)率方面有明顯差異。其中NAA 0.20mg/L+6-BA 2.50mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織長勢最好，誘導(dǎo)率也最高，達(dá)到98%。該處理愈傷組織顏色為深綠色且排列緊密，有的已經(jīng)分化出芽。

當(dāng)6-BA和2，4-D以不同濃度組合時(shí)，這9種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，而且可以看出6-BA 2.00mg/L+2，4-D 0.20mg/L培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率比其他培養(yǎng)基高。

比較這2種組合，NAA和6-BA配比其愈傷組織誘導(dǎo)率的平均效果明顯好于6-BA和2，4-D配比。

2.2 不同濃度的激素配比對葉片愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響 將誘導(dǎo)出的愈傷組織切成小塊轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，60d后觀察不同濃度生長激素組合的培養(yǎng)基中愈傷組織的生長情況，見表2。

表2 不同濃度NAA、6-BA組合對葉片愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

從表2中看出，一方面，愈傷組織的增殖率隨著NAA濃度的增加，平均增殖率先升高后逐漸減低，在濃度為0.05mg/L時(shí)平均增殖率為43.5%，當(dāng)濃度為0.10mg/L時(shí)平均增殖率最高為48.5%，當(dāng)濃度為0.20mg/L時(shí)平均增殖率最低為41.5%；另一方面，愈傷組織的增殖率隨著6-BA的濃度從0.50mg/L增加到2.00mg/L，先增加后降低，在濃度為1.00mg/L時(shí)，平均增殖率最高為65.5%。結(jié)合上述分析，當(dāng)NAA濃度為0.10mg/L、6-BA濃度為1.00mg/L時(shí)，增殖率最高，為愈傷組織最佳的增殖培養(yǎng)基。

2.3 不同濃度的激素配比對愈傷組織分化的影響將誘導(dǎo)出的健康的愈傷組織切成小塊，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過30d培養(yǎng)后，愈傷組織上先是長出顆粒狀淺綠色芽點(diǎn)，之后隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，芽點(diǎn)不斷生長，成為不定芽，接著不定芽繼續(xù)生長，逐漸長成葉片。在不定芽生長過程中，有根從基部長出，不定芽即成長為一株幼苗。再培養(yǎng)30d，不定芽葉腋中長出叢生芽成為叢生苗（表3）。

表3 不同濃度NAA、6-BA組合對愈傷組織分化的影響

由表3可見，在6-BA與NAA配合使用的培養(yǎng)基上，愈傷組織顆粒都有不同程度的分化。以MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.15mg/L+6-BA 1.00mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織分化效果最好，其分化率達(dá)到82%，而且不定芽的長勢較好。

2.4 不同濃度的生根激素對不定根誘導(dǎo)的影響選用1/2 MS培養(yǎng)基，當(dāng)無菌芽增殖形成叢生芽，每株約有2～4個(gè)芽，且高度達(dá)到1.5～2.0cm時(shí)，分別接入不同濃度的NAA和IBA生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 不同濃度NAA和IBA對生根的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，NAA和IBA 2種生長素誘導(dǎo)生根的生根率最高的均是96%，在IBA濃度為0.10mg/L時(shí)最低生根率為85%，生根率達(dá)到90%的有11個(gè)處理。試驗(yàn)表明，當(dāng)NAA和IBA濃度為0.30～0.50mg/L時(shí)，生根率均高于其他濃度。在接種10d后，有些是從接種芽的基部切口處開始長出黃白色的愈傷組織，繼而再生出幼根，此外，還有些接種后不產(chǎn)生愈傷組織而直接長出乳白色的幼根，呈雞爪狀，一般在3條以上，多的可達(dá)到6～7條。因此表明在NAA或IBA濃度為0.30～0.50mg/L條件下，1/2 MS基本培養(yǎng)基+NAA或者1/2 MS基本培養(yǎng)基+IBA都適宜組培苗生根培養(yǎng)。

3 結(jié)論與討論

3.1 主要結(jié)論 （1）適于葉片誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.20 mg/L+6-BA 2.50mg/L。（2）在對愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，最適培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.10mg/L+6-BA 1.00mg/L。（3）在愈傷組織的分化過程中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織分化培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.15mg/L+6-BA 1.00mg/L，愈傷組織的分化率達(dá)82%。（4）適于生根的培養(yǎng)基為1/2 MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.30～0.50mg/L或者1/2 MS基本培養(yǎng)基+IBA 0.30～0.50mg/L，生根率達(dá)93%及以上。3.2 討論 （1）愈傷組織的增殖數(shù)對愈傷組織的影響。從相關(guān)資料（R.M.Gosulsonda 等[6]，K.Kaul等[7]）來看，誘導(dǎo)形成的愈傷組織會在轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上之后繼續(xù)進(jìn)行增殖，但這種增殖不是無限進(jìn)行的，它會在一段時(shí)間后停止，甚至?xí)艿綋p傷，這時(shí)就需要將愈傷組織切成小塊，繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖生長，這可能與愈傷組織在增殖過程中分泌的代謝產(chǎn)物有關(guān)，這些代謝產(chǎn)物積累之后會影響愈傷組織對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，甚至?xí)τ鷤M織產(chǎn)生毒害作用，從而使愈傷組織停止增殖，更嚴(yán)重者可能會老化、褐化，甚至死亡。這與本試驗(yàn)中的現(xiàn)象基本上是一致的。（2）在試驗(yàn)過程中，雖然探討了利用萬象葉片在不同激素配比和不同激素濃度下對組培成功率的影響，但是沒有探討溫度、光照等環(huán)境因素的影響，在以后的研究中，還要繼續(xù)探討溫度、光照等環(huán)境因素對組培過程的影響。