韓 林 ，高 旸 ，王旭慧，張亞男 ，張向宇 ，孟麗娜，朱 倩

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸部，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300193）

缺血性腦血管病在全部腦血管病的發(fā)病率可高達(dá)70%[1]，是腦血管病中的最常見(jiàn)類型。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病的重要病理生理機(jī)制。腦缺血再灌注可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，但其機(jī)制仍然不明確，深入探討神經(jīng)細(xì)胞的凋亡機(jī)制，可為缺血性腦卒中的防治提供新思路。針灸治療中風(fēng)病療效明確，針灸通過(guò)經(jīng)絡(luò)、腧穴從多方面、多水平、多途徑產(chǎn)生治療效應(yīng)，是一種生物信息的傳遞，可引起細(xì)胞電生理、細(xì)胞生物學(xué)的變化。磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶（PI3K/AKT）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和糖代謝發(fā)揮重要作用,研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，能夠抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用[2]。本研究采用針刺醒腦開(kāi)竅法主穴內(nèi)關(guān)、人中、三陰交干預(yù)腦缺血再灌注模型，通過(guò)觀察海馬組織PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡率的變化，探討醒腦開(kāi)竅針刺法治療腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠（SPF級(jí)）體質(zhì)量（200±20）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（京）2016-0011。大鼠于二級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng)，室溫20～25℃，光照時(shí)間07:00～19:00，自由攝食、飲水。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵循中華人民共和國(guó)科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2 主要試劑與儀器 Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：118699000），p-AKT（Ser473）抗體（美國(guó) CST 公司，批號(hào)：13），Bax抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：GR116256-1）、Bcl-2 抗體（英國(guó) Abcam 公司,批號(hào)：GR137218－1）。Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），DYCZ-24KS型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 模型制作 參照Z(yǔ)eaLonga線栓法并加以改進(jìn)[3]，制作大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（3 mL/kg）。頸部手術(shù)區(qū)域備皮、消毒，取頸部正中稍偏左切口1.5～2 cm，分離皮下筋膜，暴露左側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區(qū)，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈分叉處遠(yuǎn)心端和近心端分別用動(dòng)脈夾夾閉，用1 mL注射器針頭在近心端血管壁穿刺，將直徑0.260 mm的尼龍線栓沿針孔緩慢插入（線栓尖端經(jīng)細(xì)砂紙打磨圓頓、光滑），待線栓前段抵達(dá)分叉處，放開(kāi)此處動(dòng)脈夾，將線栓繼續(xù)送入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至微遇阻力為止，線栓進(jìn)入顱內(nèi)深度為18～20 mm，插線成功后結(jié)扎頸總動(dòng)脈，放開(kāi)另一個(gè)動(dòng)脈夾，分層縫合。阻斷血流2 h后，拔線通過(guò)對(duì)側(cè)大腦交通動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)再灌注。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)物蘇醒后，按Zausinger 6分法[4]對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，排除評(píng)分為0、4、5分及死亡動(dòng)物，選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠進(jìn)入下一階段實(shí)驗(yàn)。MCAO造模共用52只大鼠，造模過(guò)程中無(wú)動(dòng)物死亡，4只大鼠由于神經(jīng)功能評(píng)分不合格被剔除，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充剔除動(dòng)物以保證每組動(dòng)物數(shù)。本次造模成功率為92.3%。

1.4 動(dòng)物分組及干預(yù)方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組26只大鼠。各組隨機(jī)分出8只大鼠用于流式細(xì)胞檢測(cè)，8只大鼠用于Western Blot檢測(cè)，5只大鼠用于腦梗死體積檢測(cè),其余5只大鼠用于蘇木精－伊紅（HE）染色。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，不插入尼龍線栓；模型組、電針組采用大腦中動(dòng)脈閉塞法制備腦缺血再灌注模型；電針組于造模成功后針刺內(nèi)關(guān)、人中、三陰交；假手術(shù)組、模型組大鼠同樣抓取，但不給予針刺治療。

根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的“動(dòng)物針灸穴位圖譜”，并參考大鼠的解剖結(jié)構(gòu)和體表標(biāo)志，人中位于鼻尖下1mm唇裂正中，內(nèi)關(guān)位于前肢內(nèi)側(cè)，腕關(guān)節(jié)上約3 mm，尺、橈骨間隙中；三陰交位于后肢內(nèi)踝尖直上1 cm。針具選用蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)的“華佗牌”毫針，長(zhǎng)1.5寸，直徑0.30 mm。電針儀選用韓氏神經(jīng)穴位刺激儀HANS－200E（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YZB/蘇0049－2008）。先直刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴1 mm至筋間，繼在鼻中隔下部向上斜刺人中穴1 mm，其次直刺患側(cè)三陰交穴3 mm，留針20 min；留針期間將患側(cè)內(nèi)關(guān)穴、三陰交穴針柄分別連接至韓氏神經(jīng)穴位刺激儀，施以疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，電流1 mA。首次針刺在動(dòng)物造模成功90 min后進(jìn)行，每天針刺2次，共3 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)分 神經(jīng)功能評(píng)分由專人完成，該人員并未參與手術(shù)造模和電針治療。分別于手術(shù)造模后和治療3日后對(duì)所有大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，Zausinger 6分法評(píng)定如下[4]：0分不能自發(fā)行走；1分自由走動(dòng)狀態(tài)下向病變對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)；2分抓住鼠尾，大鼠向病變對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分對(duì)于施向病變對(duì)側(cè)的側(cè)壓力抵抗力下降者；4分不能伸直病變對(duì)側(cè)前爪，甚至全身向?qū)?cè)屈曲；5分無(wú)神經(jīng)功能缺損。評(píng)分越低，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.5.2 腦梗死體積檢測(cè) 大鼠于治療結(jié)束后斷頭取腦。將腦組織置于－20℃冰箱冷凍15 min，將大腦自大腦半球額極至枕極做連續(xù)冠狀位切片，腦片厚約2 mm，切成6片，放入1%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液，37℃避光染色15 min。利用Image－Pro Plus 6.0分析軟件計(jì)算腦梗死體積，梗死體積（%）＝(對(duì)側(cè)半球體積－梗死側(cè)正常體積)/對(duì)側(cè)半球體積×100%。

1.5.3 海馬組織HE染色 剝離缺血側(cè)海馬組織，10%福爾馬林固定，經(jīng)梯度乙醇、二甲苯脫水、浸蠟、包埋、切片，蘇木素染細(xì)胞核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)，再經(jīng)梯度脫水，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡觀察，圖像采集并分析。

1.5.4 腦細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 大鼠麻醉后斷頭取腦，于冰上快速分離缺血側(cè)海馬組織，液氮研磨，1500r/min離心5 min，棄上清，用PBS制成單細(xì)胞懸液，密度為1×106/mL。每個(gè)大鼠樣本取100 μL細(xì)胞懸液（105個(gè)細(xì)胞），取 500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。每管加入 5 μL Annex in V－FITC、10 μL 碘化丙啶（PI），輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min。在流式細(xì)胞儀上，通過(guò)FITC檢測(cè)通道檢測(cè)Annexin V－FITC（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm）和通過(guò)PE檢測(cè)通道檢測(cè)PI。以二維點(diǎn)陣圖形式顯示，點(diǎn)的密度代表細(xì)胞數(shù)量，縱坐標(biāo)為PI熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為Annexin VFITC熒光強(qiáng)度，點(diǎn)陣圖顯示為4個(gè)象限：1）左下象限AnnexinV－/PI－為正常細(xì)胞。2）右下象限 Annexin V+/PI－為早期凋亡細(xì)胞。3）右上象限Annexin V+/PI+為中晚期凋亡或死亡細(xì)胞。4）左上象限Annexin V－/PI+為機(jī)械損傷的細(xì)胞。所有數(shù)據(jù)由流式細(xì)胞儀自帶的Cell Quest軟件自動(dòng)處理。

1.5.5 Western Blot蛋白表達(dá)檢測(cè) 大鼠麻醉后斷頭取腦，于冰上迅速剝離缺血側(cè)海馬組織，將海馬組織分離收集于同一個(gè)EP管中，按每20 mg組織加200～400 μL的比例加入裂解液,用手握式電動(dòng)組織細(xì)胞勻漿器在冰上將海馬腦組織制備成勻漿，于冰上靜置20 min后，12 000 r/min，離心10 min收集上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液，進(jìn)行垂直電泳，采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白由凝膠中轉(zhuǎn)至PVDF膜，一抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜、二抗（1∶3 000）37℃孵育 2 h，充分洗膜后，加ECL發(fā)光液1 mL，于凝膠成像分析系統(tǒng)中采集照片，用凝膠成效系統(tǒng)自帶軟件測(cè)定目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白的比值作為該樣本蛋白表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布計(jì)量資料治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 見(jiàn)表1。與本組治療前比較，治療后電針組神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高（P＜0.01）。與假手術(shù)組同期比較，模型組治療前、治療后神經(jīng)功能評(píng)分均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，電針組治療后神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高（P＜0.01）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s）Tab.1 Comparison of neurological deficits scores of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s）Tab.1 Comparison of neurological deficits scores of rats in each group（±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.01；與假手術(shù)組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 神經(jīng)功能評(píng)分治療前 治療后假手術(shù)組 26 5.00±0.00 5.00±0.00模型組 26 2.54±0.58# 2.65±0.56#電針組 26 2.62±0.50 3.27±0.45*△

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較 假手術(shù)組、模型組、電針組腦梗死體積比例依次為0%、（52.50±12.19）%、（23.46±7.96）%。電針組腦梗死體積比例明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)改變 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)均染，結(jié)構(gòu)正常。模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)不完整、腫脹，大量神經(jīng)元丟失、死亡，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞核溶解、固縮。電針組大鼠海馬區(qū)域細(xì)胞紊亂程度減輕，變性、壞死的神經(jīng)細(xì)胞明顯減少。

2.4 各組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡率、總凋亡率均明顯增大（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞總凋亡率明顯減?。≒＜0.05）。

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較（±s）Tab.2 Comparison of apoptosis rate of hippocampalneurons of rats in each group（±s）%

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較（±s）Tab.2 Comparison of apoptosis rate of hippocampalneurons of rats in each group（±s）%

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

分組 動(dòng)物數(shù) 早期凋亡率 晚期凋亡率 總凋亡率假手術(shù)組 8 0.386±0.281 0.113±0.069 0.499±0.337模型組 8 2.311±1.588* 0.441±0.365 2.752±1.866**電針組 8 1.148±1.070 0.231±0.153 1.379±1.161#

2.5 各組海馬組織p－Akt、Bcl－2、Bax蛋白表達(dá) 見(jiàn)表3。與假手術(shù)組比較，模型組p－Akt蛋白表達(dá)、Bcl－2/Bax比值明顯減?。≒＜0.05），Bcl－2 蛋白、Bax蛋白表達(dá)明顯增大（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，電針組 p－Akt蛋白、Bcl－2 蛋白表達(dá)、Bcl－2/Bax比值均明顯增大（P＜0.05，P＜0.01），Bax蛋白表達(dá)明顯減?。≒＜0.01）。

3 討論

內(nèi)關(guān)、人中、三陰交為醒腦開(kāi)竅針刺法主穴。多年來(lái)由石學(xué)敏院士創(chuàng)立的醒腦開(kāi)竅針?lè)◤V泛應(yīng)用于缺血性腦卒中的臨床治療，臨床效果顯著[5－6]。許多基礎(chǔ)研究也證實(shí)醒腦開(kāi)竅針?lè)蓮牟煌淖饔脵C(jī)制方面產(chǎn)生腦保護(hù)效應(yīng)。胡光強(qiáng)等[7]發(fā)現(xiàn)醒腦開(kāi)竅針刺法可能通過(guò)提高缺血再灌注損傷大鼠鼠增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和DNA的修復(fù)從而改善其神經(jīng)行為功能。孟智宏等[8]發(fā)現(xiàn)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血并發(fā)MODS后基礎(chǔ)體溫會(huì)降低，醒腦開(kāi)竅針刺治療可以提高甚至恢復(fù)大鼠基礎(chǔ)體溫，從而保護(hù)機(jī)體。李欽潘等[9]研究證實(shí)醒腦開(kāi)竅針刺法能通過(guò)促進(jìn)腦局灶性缺血再灌注大鼠腦內(nèi)VEGF與GFAP的表達(dá)，促進(jìn)缺血區(qū)大腦皮質(zhì)的血管新生及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，有效促進(jìn)大鼠局灶性腦梗死后的神經(jīng)功能恢復(fù)。

表3 各組大鼠海馬組織p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.3 Expression of p-Akt,Bcl-2 and Bax proteins in hippocampus of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠海馬組織p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.3 Expression of p-Akt,Bcl-2 and Bax proteins in hippocampus of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

Bcl－2/Bax假手術(shù)組 8 0.248±0.051 1.444±0.744模型組 8 0.188±0.057* 0.419±0.065*電針組 8 0.354±0.060**## 1.345±0.203##Bax 0.250±0.147 0.896±0.113**0.452±0.136**##分組 動(dòng)物數(shù) p－Akt Bcl－2 0.276±0.074 0.372±0.053*0.598±0.165**#

腦缺血發(fā)生后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，缺血半暗帶或梗死區(qū)周圍的神經(jīng)元死亡主要以凋亡為主，細(xì)胞凋亡可能決定最終梗死體積，因此腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制的探索以及基于抗凋亡為靶點(diǎn)的治療成為研究的熱點(diǎn)[10]。細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)雜多樣,在眾多細(xì)胞凋亡機(jī)制涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條重要的抗凋亡/促增殖信號(hào)途徑。Akt是PI3K下游重要的效應(yīng)介質(zhì)之一，是PI3K/Akt信號(hào)通路的中心樞紐和直接靶點(diǎn)，直接傳遞著PI3K的信息[11]。Kroner[12]等研究發(fā)現(xiàn)，Akt活性的最終實(shí)現(xiàn)需要Ser473位點(diǎn)的磷酸化，因此很多研究把測(cè)定p-Akt（Ser473）的水平作為Akt活化的主要標(biāo)志。蔡俊等[13]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能明顯增加大鼠皮層和海馬CA1區(qū)胞核和胞漿Akt和p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)水平，改善急性腦缺血再灌注大鼠腦組織病理?yè)p傷程度。于奎營(yíng)等[14]發(fā)現(xiàn)腹腔注射堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)可明顯增加缺血半暗帶皮層組織p-Akt(Ser473)表達(dá)，減少凋亡細(xì)胞數(shù)量，改善大鼠神經(jīng)功能。

Akt磷酸化激活后能經(jīng)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活，既可以促進(jìn)Bad，caspase-3等凋亡蛋白磷酸化，使其失活，也能夠促進(jìn)抗凋亡基因如Bcl-2，Bcl-xL等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，使細(xì)胞存活[15-16]。Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制基因，Bax是促細(xì)胞凋亡基因。在細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白和Bax蛋白可相互作用形成同源或異源二聚體，調(diào)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，調(diào)控線粒體細(xì)胞色素等的釋放，從而構(gòu)成重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控點(diǎn)之一[17]。Bax過(guò)度表達(dá)會(huì)抑制Bcl-2的作用，而促使細(xì)胞凋亡。因而決定細(xì)胞凋亡與存活的關(guān)鍵在于Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)的比例，即Bcl-2/Bax值。吳曉光等[18]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)降低血腦屏障通透性，減輕腦水腫，激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)控Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)比值，起到抑制腦出血神經(jīng)元凋亡、保護(hù)腦組織的作用。范茜茜等[19]發(fā)現(xiàn)電針“百會(huì)”、“大椎穴”可能通過(guò)以通過(guò)提升Bcl-2/Bax的比值使抗凋亡基因占據(jù)優(yōu)勢(shì)，從而抑制缺血再灌注區(qū)的細(xì)胞凋亡，減輕腦水腫，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

醒腦開(kāi)竅針刺法治療腦缺血再灌注損傷療效明確，其腦保護(hù)作用涉及多種機(jī)制。PI3K/Akt信號(hào)通路是否在醒腦開(kāi)竅針刺法作用機(jī)制中發(fā)揮作用，此前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。研究中發(fā)現(xiàn)針刺醒腦開(kāi)竅針刺法主穴內(nèi)關(guān)、人中、三陰交可明顯提高M(jìn)CAO/R大鼠神經(jīng)功能評(píng)分（P＜0.01），減小MCAO/R大鼠腦梗死體積（P＜0.01），改善MCAO/R大鼠海馬組織病理?yè)p傷，降低海馬神經(jīng)細(xì)胞總凋亡率（P＜0.05）；同時(shí)針刺內(nèi)關(guān)、人中、三陰交還可以明顯增加海馬組織p-Akt蛋白、Bcl-2蛋白的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），降低 Bax蛋白的表達(dá)（P＜0.01），提高 Bcl－2/Bax的比值（P＜0.01）。因此，筆者推測(cè)醒腦開(kāi)竅針刺法可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，增加p-Akt（Ser473）表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值，起到對(duì)抗腦缺血再灌注后凋亡發(fā)生的腦保護(hù)作用。但目前的研究仍需進(jìn)一步深入，比如針刺這種物理刺激是如何轉(zhuǎn)化為生物信號(hào)影響PI3K/Akt信號(hào)通路的，針刺激活PI3K/Akt信號(hào)通路的上游作用靶點(diǎn)是什么，是否需要進(jìn)一步加入通道阻斷劑及激活劑來(lái)驗(yàn)證假說(shuō)等等，這些工作將成為下一步研究關(guān)注的重點(diǎn)。