李延珍

（邯鄲市第一醫(yī)院，邯鄲 056002）

心臟缺血再灌注損傷是急性心肌梗死溶栓后以及多種心臟手術(shù)術(shù)后常見并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，是臨床上亟待解決的難題。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（DGMI）主要成分為銀杏內(nèi)酯，其中銀杏內(nèi)酯A占35%、銀杏內(nèi)酯B占60%、銀杏內(nèi)酯C占2%、銀杏內(nèi)酯K占2%，DGMI能夠通過修復(fù)血腦屏障、調(diào)節(jié)腦內(nèi)氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平、改善腦組織血液循環(huán)、抑制氧化應(yīng)激損傷等而對(duì)腦組織缺血性疾病具有一定的治療作用[1－3]，但DGMI對(duì)心肌缺血再灌注損傷是否能夠起到一定的保護(hù)作用的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見。本實(shí)驗(yàn)采用Langendorff灌流系統(tǒng)，建立大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，以維拉帕米為陽性對(duì)照藥物，研究DGMI對(duì)離體心臟的保護(hù)作用并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠（8周齡，220～260 g）購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（冀）2013－1－003]。飼養(yǎng)環(huán)境：23～25 ℃、相對(duì)濕度 55%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)藥物與試劑 DGMI購自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（規(guī)格：25 mg∶5 mL，批號(hào)：20170416）；維拉帕米注射液購自上海禾豐制藥有限公司（批號(hào)：43170116）；2，3，5－氯化三苯基四氮唑（TTC）購自美國Sigma公司（批號(hào)：M2128）；蘇木精－伊紅（HE）試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：161029）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、磷酸肌酸同工酶（CK－MB）試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：170101018、161209011、170117008）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、Na+－ATP、Ca2+－ATP 試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：161207、161124、160916、170118、160910）；K－H 液：用 NaCl 20.67 g、NaHCO 36.27g、KCl 1.05 g、KH2PO40.48 g、葡萄糖 5.99 g、MgSO4·7H2O 0.87 g、CaCl20.85 g 溶解于1 L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH＝7.40（自制）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組、給藥與造模 將100只實(shí)驗(yàn)用大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，DGMI低（1.5 mg/kg）、中（3 mg/kg）、高（6 mg/kg）劑量組和維拉帕米2.5 mg/kg組（陽性藥物對(duì)照組），其中DGMI中劑量組相當(dāng)于人臨床常規(guī)劑量，各組均20只；手術(shù)前2 h，DGMI各劑量組和維拉帕米2.5 mg/kg組分別腹腔注射給予相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組和模型組均給予生理鹽水。參照郭麗麗等[4]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法制備大鼠離體心臟缺血再灌注模型：腹腔注射20%烏拉坦實(shí)施麻醉后，迅速開胸，切斷主動(dòng)脈后取出心臟，置預(yù)冷（4℃）K－H液中，分離主動(dòng)脈，釆用Langendorff法逆灌含氧K－H液（充以95%O2+5%CO2），切開左心耳并由此置入帶測壓導(dǎo)管的球囊，測壓導(dǎo)管連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)。正常對(duì)照組持續(xù)以7 mL/min恒速平衡灌注K－H液（37℃）110 min，模型組、DGMI各劑量組和維拉帕米組依次行7mL/min恒速平衡灌注K－H液（37℃）20 min、停灌30 min后恢復(fù)灌注60 min，然后取材行各指標(biāo)檢測。

1.3.2 心肌酶（AST、LDH、CK－MB）活性檢測 分別取各組大鼠心臟冠脈流出液，采用生化分析法檢測心肌酶 AST、LDH、CK－MB 活性。

1.3.3 TTC染色法測定心臟組織梗死面積 每組隨機(jī)選取6只大鼠離體心臟，－20℃凍存20 min，置于2%TTC溶液恒溫（37℃）、避光孵育15 min，紅色為正常組織、灰白色為梗死區(qū)，通過BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件公司）計(jì)算梗死面積百分率。

1.3.4 HE染色法觀察心臟組織病變 每組另隨機(jī)取6只大鼠離體心臟，置4%多聚甲醛溶液固定72h，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟水化處理后，按照染色試劑盒操作步驟行HE染色，然后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察心臟組織病變。

1.3.5 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測 通過連接測壓導(dǎo)管的生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄各組大鼠離體心臟組織心率（HR）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室收縮壓（LVSP）、左室收縮壓最大上升速率（+dP/dtmax）、左室舒張壓最大下降速率（－dP/dtmin）。

1.3.6 心臟組織抗氧化酶活性，MDA含量及Na+－ATP、Ca2+－ATP活性檢測 取各組剩余的8只大鼠離體心臟組織，于4℃環(huán)境剪碎、加入適量冷裂解液后研磨勻漿,制備10%組織勻漿液，3 500 rpm離心10 min取上清液，按照各檢測試劑盒操作方法，通過紫外－可見分光光度計(jì)檢測心臟組織中抗氧化酶SOD、CAT 活性，MDA 含量以及 Na+－ATP、Ca2+－ATP活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌酶活性測定結(jié)果 結(jié)果如表1所示：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠離體心臟冠脈流出液心肌酶 AST、LDH、CK－MB 活性顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，DGMI中、高劑量組和維拉帕米組冠脈流出液 AST、LDH、CK－MB 活性顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01）。

表1 各組大鼠離體心臟冠脈流出液心肌酶活性（±s）Tab.1 Myocardial enzyme activity of coronary effluent from isolated hearts of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠離體心臟冠脈流出液心肌酶活性（±s）Tab.1 Myocardial enzyme activity of coronary effluent from isolated hearts of rats in each group（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) AST（U/L） LDH（U/L） CK－MB（U/L）正常對(duì)照組 20 9.81± 1.98 8.56± 2.74 680.27± 75.18模型組 20 63.86±14.72**91.64±15.08**1 785.41±270.95**DGMI低劑量組 20 54.01±14.29 73.68±13.94△ 1 512.48±211.03 DGMI中劑量組 20 27.38± 5.73## 48.26±11.72## 1 090.37±186.19#DGMI高劑量組 20 15.80± 4.19## 26.30± 8.17## 986.82±171.36##維拉帕米組 20 39.69±12.54# 54.07±13.15## 1 079.63±187.42#

2.2 心肌組織梗死面積測定結(jié)果 結(jié)果如表2所示：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠離體心肌組織梗死面積百分率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，DGMI中、高劑量組和維拉帕米組心肌組織梗死百分率顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01）。

表2 各組大鼠離體心臟梗死面積百分率測定結(jié)果（±s）Tab.2 Percentage of isolated myocardial infarct area in each group of rats（±s）

表2 各組大鼠離體心臟梗死面積百分率測定結(jié)果（±s）Tab.2 Percentage of isolated myocardial infarct area in each group of rats（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 梗死百分率（%）正常對(duì)照組 6 0.00±0.00模型組 6 42.37±4.51**DGMI低劑量組 6 38.46±5.29 DGMI中劑量組 6 31.81±5.30#DGMI高劑量組 6 23.05±4.08##維拉帕米組 6 31.14±4.75#

2.3 心臟組織病變觀察結(jié)果 結(jié)果如圖1所示：正常對(duì)照組大鼠離體心臟組織細(xì)胞形態(tài)未見異常；模型組心臟組織呈現(xiàn)肌原纖維斷裂、間隙增寬、排列紊亂，細(xì)胞空泡變性、細(xì)胞質(zhì)著色不均、胞核深染等病變；較模型組，DGMI中、高劑量組和維拉帕米組離體心臟組織病變呈現(xiàn)不同程度改善，其中以DGMI高劑量組效果較為顯著。

圖1 各組大鼠離體心臟組織形態(tài)（HE×200）Fig.1 Heart tissue morphology of the rat in each group(HE×200)

2.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果 結(jié)果如表3所示：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（HR、LVSP、+dP/dtmax、－dP/dtmin）顯著下降而LVEDP顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，DGMI中、高劑量組和維拉帕米組 HR、LVDP、+dP/dtmax、－dP/dtmin顯著升高且LVEDP顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 抗氧化酶（SOD、CAT）活性及MDA含量測定結(jié)果 結(jié)果如表4所示：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠離體心臟組織SOD、CAT顯著降低且MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，DGMI中、高劑量組和維拉帕米組SOD、CAT活性顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01），MDA 含量顯著降低（P＜0.01）。

2.6 Na+－ATPase、Ca2+－ATPase 活力測定結(jié)果 結(jié)果如表5所示：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠離體心臟組織 Na+－ATP、Ca2+－ATPase 活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，DGMI中、高劑量組和維拉帕米組 Na+－ATPase、Ca2+－ATPase 活力顯著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。

3 討論

隨著高血壓、高脂血癥等患病人群的增多，冠心病以及由其所引發(fā)的急性心肌梗死發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。目前，臨床上以使冠狀動(dòng)脈再通、恢復(fù)血流再灌注是治療缺血性心臟病的首選方案，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥嚴(yán)重影響著患者預(yù)后。近年來，郭志祥[5]和劉家袁等[6]研究發(fā)現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激損傷以及ATPase活性降低是心肌缺血再灌注損傷主要病理機(jī)制，這也為研發(fā)能夠有效降低缺血再灌注損傷的新型藥物提供了思路。

銀杏葉為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木銀杏的葉，是中國傳統(tǒng)中藥品種，《本草綱目》和《中藥志》中均有記載，其性味甘苦澀平，具有益心斂肺、化濕止瀉之功效?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，銀杏二萜內(nèi)酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、K等，既往研究發(fā)現(xiàn)銀杏二萜內(nèi)酯具有多種生物學(xué)活性并且對(duì)腦組織缺血性損傷具有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)釆用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，模擬心肌缺血再灌注損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)DGMI預(yù)處理能夠有效降低離體心臟冠脈流出液AST、LDH、CK－MB活性、降低心肌組織梗死面積、抑制心肌組織病變，表明DGMI能夠減輕心肌組織細(xì)胞損傷、改善心功能，提示DGMI對(duì)離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

表3 各組大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（±s）Tab.3 Hemodynamic parameters of isolated hearts in each group（±s）

表3 各組大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（±s）Tab.3 Hemodynamic parameters of isolated hearts in each group（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)HR（次/min）LVEDP（mmHg）LVSP（mmHg）+dP/dtmax（mmHg/s）－dP/dtmin（mmHg/s）正常對(duì)照組 20 277.02±27.38 7.41±2.35 87.12±9.65 2 401.27±325.38 1 924.16±274.91模型組 20 242.98±23.82** 35.29±9.42** 61.08±9.60** 954.69±196.12** 781.88±195.34**DGMI低劑量組 20 250.74±23.73 25.99±6.17 63.94±9.75 1 045.80±214.75 896.37±203.01 DGMI中劑量組 20 261.09±24.28# 21.54±5.36# 71.83±9.61# 1 468.27±239.48# 1 140.89±231.25#DGMI高劑量組 20 267.56±26.05# 16.70±4.58## 78.90±10.17## 1 762.84±273.81## 1 492.71±244.85##維拉帕米組 20 265.00±24.03# 18.71±4.97# 74.26±9.75# 1 693.67±220.07## 1 416.02±219.74##

表4 各組大鼠離體心臟組織SOD、CAT活性及MDA 含量（±s）Tab.4 Activity of SOD,CAT and the content of MDA of isolated hearts in each（±s）

表4 各組大鼠離體心臟組織SOD、CAT活性及MDA 含量（±s）Tab.4 Activity of SOD,CAT and the content of MDA of isolated hearts in each（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

MDA（nmol/mgPro）正常對(duì)照組 8 67.83±4.92 37.48±4.67 3.68±0.70模型組 8 37.24±3.75** 16.29±3.50** 9.74±1.54**DGMI低劑量組 8 41.30±4.61 20.16±3.75 8.16±1.48 DGMI中劑量組 8 49.21±5.07# 24.04±3.32# 6.53±1.39##DGMI高劑量組 8 57.75±5.62## 30.95±4.38# 5.60±1.02##維拉帕米組 8 48.97±5.28# 22.16±4.31 6.82±1.17##組別 動(dòng)物數(shù) SOD（U/mgPro）CAT（U/mgPro）

表5 各組大鼠離體心臟Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力活性（±s）Tab.5 Activity of Na+-ATPase、Ca2+-ATPase of isolated hearts in each group（±s）

表5 各組大鼠離體心臟Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力活性（±s）Tab.5 Activity of Na+-ATPase、Ca2+-ATPase of isolated hearts in each group（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

Ca2+－ATPase（μmol Pi/mgprot/h）正常對(duì)照組 8 1.71±0.73 1.48±0.39模型組 8 0.76±0.20** 0.64±0.21**DGMI低劑量組 8 0.85±0.26 0.95±0.34 DGMI中劑量組 8 1.49±0.35# 1.32±0.38##DGMI高劑量組 8 1.91±0.62## 1.81±0.40##維拉帕米組 8 1.89±0.70## 1.80±0.39##組別 動(dòng)物數(shù) Na+－ATPase（μmol Pi/mgprot/h）

血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)正常是保證心臟功能的基礎(chǔ)，其中 HR、LVEDP、LVSP、+dP/dtmax、－dP/dtmin是衡量血流動(dòng)力學(xué)的重要指標(biāo)；其中，HR能夠反應(yīng)心臟的整體功能，LVEDP能夠反映舒張期左室內(nèi)壓變化、LVSP反映收縮期左室內(nèi)壓變化，LVEDP和LVSP能夠體現(xiàn)心肌順應(yīng)性；+dp/dtmax反映心肌收縮程度、－dp/dtmax反映心肌舒張功能，兩者是評(píng)價(jià)心肌收縮性能和舒張性能的敏感指標(biāo)[7－8]。心肌缺血/再灌注可能降低心肌舒縮功能，而表現(xiàn)為心輸出量減少及±dp/dtmax指標(biāo)降低[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DGMI預(yù)處理能夠有效提高離體心臟 HR、LVDP、+dP/dtmax、－dP/dtmin并降低LVEDP，提示DGMI具有改善離體心臟缺血再灌注損傷后血流動(dòng)力學(xué)的藥理學(xué)作用。

氧化應(yīng)激損傷是心臟組織缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一[10]，體內(nèi)氧自由基代謝失衡是氧化應(yīng)激損傷的病理基礎(chǔ)，SOD、CAT是體內(nèi)清楚氧自由基的關(guān)鍵還原酶[11－12]，MDA為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，因此SOD、CAT活性和MDA含量能夠間接反應(yīng)心肌組織損傷的程度[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DGMI預(yù)處理能夠有效改善抗氧化酶（SOD、CAT）活性并降低MDA含量，提示DGMI具有抑制離體心臟缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷的作用。

綜上所述，DGMI能夠減輕心肌組織細(xì)胞損傷、改善心功能，提示DGMI對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，可能與DGMI能夠改善血流動(dòng)力學(xué)、抑制氧化應(yīng)激損傷以及改善Na+－ATPase、Ca2+－ATPase 活性有關(guān)。