邢桉榮 ，常廣璐 ，王志強(qiáng) ，何燕峰 ，曹麗娟 ，李天祥

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津天士力中藥科技發(fā)展有限公司，天津 300410；3.天津盛實百草藥業(yè)有限公司，天津 300301）

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，迄今已有2 000多年臨床應(yīng)用歷史，是臨床常用大宗藥材之一[1]。自20世紀(jì)60年代開始，各地對丹參進(jìn)行廣泛引種栽培[2]。但在丹參人工栽培過程中，種質(zhì)混雜、栽培技術(shù)不規(guī)范，影響了丹參的品質(zhì)和臨床療效[3]。因此，選擇適宜的丹參種植基地以及品種優(yōu)良的丹參種源，規(guī)范丹參栽培、采收技術(shù)，合理輪作、防治病蟲害成為提高丹參產(chǎn)量與質(zhì)量的研究重點。

前期項目對天津野生中藥資源進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，天津薊縣北部山區(qū)有野生丹參分布，并初步進(jìn)行評價：藥材品質(zhì)較佳，活性成分含量較高，其中丹參酮類成分含量高達(dá)0.908%，是《中國藥典》2015版限量標(biāo)準(zhǔn)的3.6倍。因此，在天津地區(qū)引種丹參具備一定的可行性。自2013年起，本研究從河南、山東、陜西、河北、安徽等丹參的國內(nèi)主產(chǎn)區(qū)或道地產(chǎn)區(qū)引進(jìn)丹參種苗，分別在天津薊州區(qū)、武清區(qū)、靜海區(qū)引種同一種源地丹參種苗；于天津靜海區(qū)引種不同種源地的丹參種苗，進(jìn)行綜合評價。對引種后丹參的藥材干重、有效成分含量、重金屬及有害元素含量等質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)分析，探索在天津地區(qū)引種丹參的可行性，并為進(jìn)一步尋找丹參新的培育基地提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器 Alltech 1500系列Q05型高效液相色譜儀（美國Alltech科技有限公司）；UV-6100紫外可見分光光度計（上海美普達(dá)有限公司）；iCE 3500原子吸收光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；AF-610A原子熒光光譜儀（北京瑞利分析儀器公司）；EH35A plus電加熱板（美國Lab-Tech公司）；FA 2104電子天平（200 g，上海舜宇恒平科技儀器有限公司）；SB25-12DT超聲波清洗機(jī)（功率140 W，頻率42 kHz，寧波新芝生物科技股份有限公司）；DFZ-6050型真空干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；元素空心陰極燈（北京曙光明電子光源儀器有限公司）。

1.2 試劑 硝酸、高氯酸為優(yōu)級純；丹參酮IIA對照品（批號MUST-14060802）、丹酚酸B對照品（批號MUST-13103113）、蘆丁對照品（批號 MUST-12040302）購于成都曼斯特；甲醇（天津市康科德科技有限公司）、乙腈（天津市福晨化學(xué)品有限公司）為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑為分析純；單元素Cu、Cd、Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液，離子濃度為1000μg/mL，As、Hg 標(biāo)準(zhǔn)溶液，離子濃度為 100 μg/mL，均購于天津傲然精細(xì)化工研究所；GBW 07603－生物成分分析灌木枝葉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購于中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘察研究所。

1.3 材料 實驗地栽培丹參種苗分別購于山東日照、陜西商洛、安徽亳州、河南方城、河南信陽大別山區(qū)，此外“天丹一號”種苗由天津天士力中藥資源科技發(fā)展有限公司提供，航空育種苗由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。種苗經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的幼苗。

1.4 實驗田基本信息 實驗區(qū)為天津地區(qū)，本區(qū)處于溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，年平均降水量520～600mm，日照時數(shù)1 450～1 700 h，年均溫11℃～13℃，無霜期200～250 d。土壤狀況見表1。

2 方法

2.1 丹參酮ⅡA、丹酚酸B的測定

2.1.1 對照品儲備液的制備 取丹參酮ⅡA、丹酚酸B對照品適量，精密稱定，分別置棕色容量瓶中，加甲醇配置成含丹參酮ⅡA、丹酚酸B各0.654mg/mL、1.120 mg/mL的對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 丹參酮類成分 精密稱取本品粉末（過三號篩）0.300 0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，放冷，甲醇補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。丹酚酸B：精密取本品粉末（過三號篩）0.1500g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，80%甲醇溶液補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 丹參酮類成分Agilent Eclipse XDB－C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）－0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0～2 min，61%A；2～10 min，61%～90%A；10～10.5 min，90%～61%A；10.5～20 min，61%A；體積流量 0.9 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長270 nm。

丹酚酸BAgilent Eclipse XDB－C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B）（22∶78）；體積流量 1.2 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長286 nm。見圖1。

2.2 總黃酮、總酚酸含量的測定

2.2.1 對照品儲備液的制備 分別取蘆丁、丹酚酸B對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加水分別配置成含蘆丁1.370 mg/mL，含丹酚酸B 1.100 mg/mL的對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 丹參酮類成分 樣品精密稱定后，置100 mL具塞三角瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，70℃加熱回流1 h，放冷，70%乙醇補(bǔ)重，搖勻，濾過，取上清液，即得。

丹酚酸B樣品精密稱定后，置100mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲40 min，放冷，甲醇補(bǔ)重，搖勻，濾過，取上清液，即得。

2.2.3 顯色方法及測定方法 總黃酮UV－VIS法測定丹參中總黃酮的含量。精密移取供試品溶液1.0 mL至10 mL刻度管中，加水至2 mL，加10%NaNO21.5 mL及10%Al（NO3）30.5 mL，暗處放置5 min，加5 mol/L NaOH 4 mL顯色，定容至刻度，暗處反應(yīng)10 min，以顯色劑為空白，波長495 nm測定吸光度。

總酚酸 UV－VIS法測定丹參中總酚酸的含量。精密移取供試品溶液1.0 mL至10 mL刻度管中，加水至2 mL，加10%NaNO22.0 mL及10%Al（NO3）30.75 mL，暗處放置 5 min，加 5 mol/L NaOH 4 mL顯色，定容至刻度，暗處反應(yīng)10 min，以顯色劑為空白，波長510 nm測定吸光度。

表1 實驗田土壤狀況等基本信息Tab.1 Basic information of experimental plots

圖1 對照品（A、B）和丹參樣品（C、D）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard compounds(A、B)and Salviasample(C、D)

2.3 無機(jī)元素含量測定 精密稱取0.5g試樣（60目）于50 mL聚四氟乙烯燒杯中，加入10 mL混合酸（硝酸∶高氯酸=4∶1，體積比），蓋上表面皿，置于通風(fēng)櫥內(nèi)預(yù)消解。次日于100℃電熱板上消解2 h，補(bǔ)加硝酸3 mL，然后120℃、140℃各消解2 h，用3 mL硝酸沖洗表面皿，經(jīng)常搖動燒杯，趕酸至白煙冒盡，定容至50 mL，其中1%硝酸定容用于原子吸收分光光度法（FAAS）測定Cu元素的含量，石墨爐原子吸收分光光度法（GFAAS）測定Cd、Pb元素的含量；5%鹽酸定容用于原子熒光光度法（AFS）測定As、Hg元素的含量。每批樣品同時消解灌木枝葉分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并制備全程序空白溶液，所有樣品均采用平行雙樣。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取丹參酮ⅡA、丹酚酸B、蘆丁、無機(jī)元素對照品溶液，分別加水稀釋成適宜濃度，注入高效液相、原子吸收、原子熒光或紫外可見分光光度計，測定其峰面積或吸光度。以峰面積或吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

2.4.2 精密度實驗 精密吸取各對照品溶液適量，按色譜條件重復(fù)6次，測定各峰面積或吸光度，得RSD值，按表3順序分別為0.83%、0.65%、0.98%、0.55%、0.33%、0.26%、0.36%、1.20%、2.53%。

表2 丹參指標(biāo)成分及無機(jī)元素的回歸方程及線性范圍Tab.2 regression equation and linear range of index components and inorganic elements of Salvia miltiorrhiza

2.4.3 重復(fù)性實驗 精密稱定樣品6份，配制各供試品溶液，進(jìn)樣，分別測定其峰面積或吸光度，得RSD值，按表3順序分別為1.49%、2.47%、2.75%、2.16%、0.86%、3.39%、1.54%、2.06%、1.02%。

2.4.4 穩(wěn)定性實驗 精密吸取各對照品溶液，每隔2 h（丹參酮 IIA，丹酚酸 B）、20 min（總黃酮，總酚酸）進(jìn)樣，分別測定其峰面積或吸光度，得RSD值分別為2.26%、0.86%、1.69%、0.64%，表明其在一定時間內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率實驗 精密稱定樣品6份，分別加入對照品適量，按各供試品溶液項下制備，測定其峰面積或吸光度，計算各加樣回收率，按表3順序分別為 103.78%、98.77%、104.53%、103.77%、0.48%、1.45%、1.36%、2.65%、2.58%。

2.5 樣品測定 大田取樣方法，采用樣方法取樣，每個品種取樣10份，每個樣品重復(fù)取樣10次。

3 結(jié)果

3.1 天津地區(qū)引種丹參的可行性

3.1.1 質(zhì)量指標(biāo)的測定 《中國藥典》（2015年版）規(guī)定丹參藥材中丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮三者之和不得少于0.25%，丹酚酸B含量不得少于3.0%[4]。薊縣區(qū)、靜海區(qū)、北辰區(qū)引種山東丹參種苗后，其藥材中丹參酮類、總黃酮、丹酚酸B及總酚酸含量均滿足藥典標(biāo)準(zhǔn)，以北辰區(qū)產(chǎn)最大，分別為4.97、41.18、51.85、63.96 mg/g；靜海區(qū)產(chǎn)次之，分別為3.30、28.03、49.77、53.59 mg/g；薊縣區(qū)產(chǎn)最低，分別為 3.01、26.20、42.81、42.95 mg/g，各產(chǎn)地兩兩比較均有極顯著差異。干重以靜海區(qū)（128.86 g/株）最大，薊縣區(qū)（106.80 g/株）次之，北辰區(qū)（54.68 g/株）最低。比較北辰區(qū)與薊州區(qū)、靜海區(qū)土壤質(zhì)地差異發(fā)現(xiàn)，薊州區(qū)、靜海區(qū)為黏質(zhì)土，北辰區(qū)為砂質(zhì)土；北辰區(qū)土壤中的有機(jī)質(zhì)含量、CEC值、水解氮含量、速效磷含量均低于薊州區(qū)與靜海區(qū)。分析原因，可能是砂質(zhì)土中營養(yǎng)成分缺乏的脅迫作用有利于丹參二次代謝產(chǎn)物的累積，黏質(zhì)土中豐富的營養(yǎng)成分則有利于丹參產(chǎn)量的增長。

3.1.2 重金屬元素及有害元素含量的測定 各地區(qū)引種丹參后藥材中 Pb、Cd、As、Hg、Cu 含量分別為：薊縣區(qū)為 0.705、0.046、0.341、0.074、13.005mg/kg；靜海區(qū)為 0.444、0.031、0.712、0.005、14.589 mg/kg；北辰區(qū)為 0.792、0.035、0.070、0.078、16.392 mg/kg。均低于藥代限量標(biāo)準(zhǔn)。

由上考察結(jié)果可知：天津地區(qū)引種丹參指標(biāo)成分含量均達(dá)到藥典限量標(biāo)準(zhǔn)，且重金屬及有害元素含量均低于藥典限量標(biāo)準(zhǔn)；綜合考慮引種丹參干質(zhì)量、指標(biāo)成分含量等因素，靜海區(qū)引種丹參質(zhì)量較優(yōu)：單株干質(zhì)量達(dá)128.86，丹參酮類成分含量達(dá)0.33%，丹酚酸B含量達(dá)4.98%。因此，天津靜海區(qū)可作為丹參新的栽培基地較為合理。

3.2 不同產(chǎn)地丹參種苗引種天津后的質(zhì)量

3.2.1 產(chǎn)量及不同種源指標(biāo)結(jié)果 陜西商洛種源丹參引種后丹參酮類含量為0.183%，天丹1號、河南大別山、河南方城種源丹參引種后丹酚酸B含量分別為2.542%、2.415%、2.583%，均低于藥典標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量不合格。山東日照、航空育種、安徽亳州種源丹參引種后質(zhì)量合格，藥材干質(zhì)量、丹參酮類、總黃酮、丹酚酸B及總酚酸含量分別為：山東日照為128.86 g/株、3.30、28.03、49.77、53.59 mg/g；航空育種為 76.16g/株、2.67、17.23、37.35、43.89 mg/g；安徽亳州為 60.58 g/株、2.68、29.91、48.61、52.28 mg/g。其中，藥材干重以及丹參酮類、丹酚酸、總酚酸含量均以山東日照種源引種后藥材最高，總黃酮含量雖低于安徽亳州種源引種后藥材，但無顯著性差異。因此，可認(rèn)為種源地為山東日照丹參種苗引種天津栽培后的質(zhì)量較優(yōu)。

3.2.2 重金屬及有害元素含量測定結(jié)果 重金屬及有害元素含量測定結(jié)果 對質(zhì)量合格品藥材進(jìn)行元素測定，其 Pb、Cd、As、Hg、Cu 含量分別為：山東日照為 0.444、0.031、0.712、0.005、14.589 mg/kg；航空育種為 0.579、0.033、0.293、0.152、11.613 mg/kg；安徽亳州為 0.529、0.026、0.439、0、13.410 mg/kg。均符合藥典限量標(biāo)準(zhǔn)。

4 討論

天津地區(qū)氣候干旱較嚴(yán)重，年平均降水量為571 mm，日數(shù) 64～73 d，降雨時間集中在 7～8 月；降雨區(qū)域主要集中在東部沿海與北部山區(qū)[5]。同時，天津地區(qū)土質(zhì)具有鹽漬化特點，尤其是濱海區(qū)。獨特的土壤及氣候特點，對天津引種丹參的品質(zhì)形成和產(chǎn)量，拓展了新的研究空間。靜海區(qū)土壤為鹽化潮質(zhì)土、中黏土，引種后的丹參干質(zhì)量最大，畝產(chǎn)量高，有效成分含量僅次于北辰區(qū)，但藥材干質(zhì)量為北辰區(qū)的2.32倍。分析原因，可能與不同土壤質(zhì)地中，營養(yǎng)成分的含量以及干旱的脅迫作用有關(guān)。一般黏質(zhì)土中有機(jī)質(zhì)、水解氮、速效氮的含量一般高于砂質(zhì)土，有利于丹參生長，藥材干質(zhì)量較高，產(chǎn)量較大。黃璐琦[6]等提出，環(huán)境脅迫可能會刺激植物代謝產(chǎn)物的累積，砂質(zhì)土對于丹參生長具有一定的干旱脅迫作用，有利于藥材中酚酸類成分的產(chǎn)生?？梢?，北辰區(qū)砂質(zhì)土所栽培丹參中有效成分含量高是合理的。

天津靜海主要為鹽漬化土質(zhì)，鹽堿化程度較高，礦物質(zhì)養(yǎng)分較充足（CEC值高）。由于地下水位高，泛堿、泛鹽時常發(fā)生。上述不利的土質(zhì)狀況相反會極大促進(jìn)、提高土壤表土與底土的養(yǎng)分交換能力，使表土肥力常新，結(jié)果能及時糾正中藥材種植連作障礙造成養(yǎng)分供給失衡。這是其他丹參道地產(chǎn)區(qū)土壤不具備的特點。因此，可以推測，靜海鹽漬化土質(zhì)這些潛在優(yōu)勢，可能減輕或緩解丹參連作重茬問題。

不同產(chǎn)地丹參種苗引種天津靜海區(qū)后，以山東日照種源栽培丹參質(zhì)量最優(yōu)。山東、山西、陜西、河南、河北、湖北、四川、安徽都曾被視為丹參的道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)。張興國等[7]通過對大田生產(chǎn)丹參進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)丹參有白花、紫花、皺葉、小葉、高莖、矮莖等多種種質(zhì)類型，可見，目前丹參種質(zhì)品系不純現(xiàn)象比較嚴(yán)重；此外，由于長期采用無性繁殖，種質(zhì)退化也較嚴(yán)重；不同產(chǎn)地交互引種，品種混亂，導(dǎo)致商品質(zhì)量和產(chǎn)量極不穩(wěn)定[8]。因此，對道地產(chǎn)區(qū)丹參優(yōu)良種質(zhì)進(jìn)行純化，在適宜環(huán)境下開展引種系統(tǒng)研究、質(zhì)量評價，尋找新產(chǎn)地，擴(kuò)大種植面積，為市場提供豐富的藥材資源，以解決臨床用藥供需矛盾。

5 結(jié)論

山東日照丹參種苗引種天津薊州區(qū)、北辰區(qū)、靜海區(qū)后，栽培品指標(biāo)成分均滿足藥典標(biāo)準(zhǔn)，重金屬及有害元素含量低于藥典限定標(biāo)準(zhǔn)，且以靜海區(qū)引種丹參品質(zhì)較優(yōu)。丹參酮類以及丹酚酸B含量分別為藥典標(biāo)準(zhǔn)的1.32、1.66倍，適宜作為天津地區(qū)引種丹參種源。