劉建萍，王進博，王 洋，陳 濤

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2.國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品審評中心，北京 100070）

丹芪偏癱膠囊為國家中藥6類新藥，由丹參、黃芪、赤芍等14味藥物組成，主要用于腦梗死的恢復期[1－2]。有研究表明，丹芪偏癱膠囊可以增加中風患者的腦血流量[3]，改善功能性自立及神經(jīng)修復[4]，對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能與減輕腦水腫、抗氧化及抑制血漿內(nèi)皮素（ET）生成有關[5]。臨床研究表明，口服丹芪偏癱膠囊治療中風后遺癥130例，療程2個月，總有效率達到96.92%，患者治療后較治療前臨床癥狀改善明顯[6]。

慢性腦缺血又稱為慢性低灌注，即慢性的腦血流量供應不足，可對腦組織造成不同程度的損傷，是臨床常見的一種病理狀態(tài)，具有存活率低、致殘率高、病程長等特點。其多伴于血管性癡呆、阿爾茨海默病等疾病的發(fā)病過程[6]，發(fā)病的早起主要表現(xiàn)是認知功能的損害，而認知功能包括學習、記憶、定向能力和思維能力等內(nèi)容，因此評價認知功能的主要指標是學習記憶能力的改善[7]。為探討丹芪偏癱膠囊對慢性腦缺血的治療作用，實驗采用改良的Pulsinell四動脈結(jié)扎手術制備大鼠模型，觀察丹芪偏癱膠囊對腦缺血大鼠平衡及學習記憶能力的影響，為驗證其治療缺血性腦病的有效性提供實驗基礎。

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（230±20）g（購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014－0004，置于實驗室適應性飼養(yǎng)1周后用于實驗。室溫（20±2）℃，濕度60%±5%。

1.2 藥品 丹芪偏癱膠囊（批號：201505007，天津市石天藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)）。

1.3 儀器 MorriS水迷宮視頻分析系統(tǒng)（淮北正華生物儀器設備有限公司）；大小鼠疲勞儀（DXP－2，中國醫(yī)學科學院藥物研究所）。

2 方法

2.1 實驗流程 大鼠造模前分別進行Morris水迷宮、平衡能力實驗，篩選符合造模的大鼠。造模2周后，造模成功的大鼠平均分組，給藥治療。造模成功大鼠連續(xù)給藥4周。

2.2 前腦缺血模型制備 四動脈結(jié)扎大鼠缺血模型（Forebrain）被廣泛應用于學習記憶能力研究，是全腦缺血的經(jīng)典模型。本項目擬采用本課題組前期建立的實驗方法進行模型復制，簡要步驟如下：大鼠禁食24 h后，頸部、頭部刮毛備皮，分離雙側(cè)頸總，埋線，縫合。大鼠腦立體定位儀固定，俯臥，電凝第一頸椎橫突孔下雙側(cè)椎動脈，縫合，消毒。24 h后大鼠于清醒狀態(tài)，夾閉雙側(cè)頸總15 min，然后開放動脈夾再灌注。實驗過程中，保持肛溫（37±0.5）℃，以大鼠出現(xiàn)意識消失、眼球蒼白、瞳孔散大、呼吸加深加快，對疼痛刺激無反應、翻正反射和瞳孔對光反射消失，為模型成功標志。模型不成功或出現(xiàn)驚厥癲癇狀態(tài)的大鼠棄除。假手術組只分離雙側(cè)頸總，找到第一頸椎橫突孔，不電凝，不夾閉頸總動脈。

2.3 實驗分組和給藥方法 分為假手術組、模型組、丹芪偏癱膠囊組，根據(jù)前期實驗[8]確定的丹芪偏癱膠囊的有效劑量給藥（43.2 mg/mL），模型組和假手術組給予羧甲基纖維素鈉溶液。造模后2周開始給藥，給藥周期為1個月。模型組和假手術組給濃度為0.005 mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液，給藥組給濃度為43.2 mg/mL的丹芪偏癱膠囊的羧甲基纖維素鈉溶液。按正常人體質(zhì)量為60 kg計算，大鼠的標準體質(zhì)量為200g，丹芪偏癱膠囊人的臨床給藥計量為4.8g/d，按《中國藥典》體表面積計算法，大鼠給藥劑量為432 mg/kg。

2.4 MorriS水迷宮實驗

2.4.1 水迷宮裝置 Morris水迷宮由圓形水池、平臺以及記錄裝置三部分組成。水池用不銹鋼板制成，直徑1.2 m，高50 cm，厚3 mm，內(nèi)壁為黑色，周圍由黑色幕布圍住。池壁上等距離標記東、南、西、北4個入水點，東西及南北兩點連線將水池等分為4個象限，分別稱西南（SW）、西北（NW）、東南（SE）及東北（NE）象限，將一個直徑為12 cm、高為28 cm的圓柱形平臺固定放置于SW象限的中心位置上，平臺頂部沒于水面下1 cm，水迷宮內(nèi)置加熱和測量溫度裝置，水溫恒定，保持在（25±1）℃之間。池壁、池底及平臺均用黑色膠紙粘貼，水顏色染為黑色，目的是徹底的隱藏平臺，讓小鼠在水中不能通過視覺來辨認平臺。在水中實驗的目的是使大鼠失去嗅覺感應，只能通過記憶尋找平臺以達到隱蔽平臺的目的。記錄分析裝置由攝像裝置(懸掛于水池正上方約2 m處）和電腦分析系統(tǒng)組成。測試期間，周圍環(huán)境以及水迷宮池壁上的參照物均保持不變，并保持室內(nèi)安靜。

2.4.2 定位航行實驗 測試的前一天，為了減少應激反應對實驗結(jié)果的影響，各組實驗大鼠在學習訓練前均被放于除去平臺的Morris水迷宮中約90 s，以熟悉環(huán)境降低應激反應，適應活動結(jié)束后將平臺放回原處。實驗時平臺位置固定不變，分別使大鼠從不同象限的入水點入水，訓練時將動物面朝池壁輕輕放入水中，記錄鼠從入水到找到平臺的游泳路線的長度及找到平臺的時間。如果90 s內(nèi)找不到平臺，潛伏期記為90 s，并將鼠引于平臺上記憶30 s。訓練結(jié)束后計算各組動物潛伏期平均值，共進行5d。

2.4.3 空間探索實驗 定位航行實驗結(jié)束24 h后，撤除平臺，從原平臺對側(cè)象限入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在90 s內(nèi)的游泳路徑、原平臺象限的停留時間、穿越原平臺位置的次數(shù)及其運動速度進行統(tǒng)計分析，并記錄其運動軌跡。

2.5 平衡能力實驗 將鼠放在大鼠疲勞儀上，第一次以4 r/min恒定轉(zhuǎn)速適應2 min，20 rpm/min適應1 min。接著將疲勞儀的轉(zhuǎn)速調(diào)整，調(diào)整方式為：在1 min鐘按恒定速率將轉(zhuǎn)速由0 rpm/min升高到28 r/min，并讓大鼠在28 rpm/min轉(zhuǎn)速的疲勞儀上保持5 min，在這6 min的時間內(nèi)記錄大鼠掉落的次數(shù)以及維持在疲勞儀上的最長時間，測3次，取平均值。

2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05認為統(tǒng)計學有意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠水迷宮實驗結(jié)果

3.1.1 定位航行實驗 1）在造模前的水迷宮實驗中，主要是篩掉一些個體差異比較大的大鼠，用以減小個體差異對實驗結(jié)果的影響，所以只選擇了基礎值一樣、個體差異小的大鼠來進行后續(xù)的實驗。為了消除大鼠個體間的差異，特在實驗造模前進行了水迷宮篩選，隨著訓練時間的延長，大鼠到達平臺的時間會逐漸縮短，各組大鼠之間沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2）給藥兩周后的水迷宮實驗結(jié)果，見表1，將給藥2周后的模型組與假手術組進行比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），模型組大鼠的逃避潛伏期明顯增加，同時將模型組大鼠與造模前篩選后的鼠進行比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明四動脈結(jié)扎手術成功造成了大鼠腦缺血，記憶能力下降。給藥組和模型組比較結(jié)果表明，也存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05），丹芪偏癱膠囊給藥組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，說明丹芪偏癱膠囊對慢性腦缺血大鼠的學習記憶能力有一定的保護作用。

3）給藥4周后的水迷宮定位航行實驗結(jié)果如表2所示，給藥4周后，模型組與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），模型組的逃避潛伏期明顯增加；模型組與給藥組比較，亦出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（P＜0.05），給藥組逃避潛伏期明顯減少,說明丹芪偏癱膠囊能改善四動脈結(jié)扎大鼠的學習能力。

3.1.2 空間探索實驗 空間探索實驗主要考察大鼠在平臺象限停留的時間以及穿越平臺的次數(shù)，在平臺象限停留時間越長、穿越平臺次數(shù)越多則表示大鼠的記憶能力越強。

1）在給藥2周和4周時，大鼠在平臺所在象限停留時間的實驗結(jié)果，見表3。在給藥2周和4周時分別進行空間探索實驗，給藥2周時的實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠在平臺所在象限的停留時間相比于假手術組明顯縮短（P＜0.01），丹芪偏癱膠囊給藥組與模型組相比，給藥組大鼠的停留時間明顯增加（P＜0.01）；給藥4周的實驗結(jié)果顯示，模型組與假手術組相比，模型組大鼠在平臺所在象限停留的時間明顯減少（P＜0.05），丹芪偏癱膠囊給藥組與模型組相比，給藥組大鼠的停留時間顯著增高（P＜0.01），說明丹芪偏癱膠囊對四動脈結(jié)扎所致的慢性腦缺血大鼠的記憶能力具有改善作用。

2）在給藥2周和4周時，大鼠穿越平臺次數(shù)的實驗結(jié)果，見表4。在給藥2周和4周時的大鼠穿越平臺次數(shù)的實驗結(jié)果顯示，給藥2周時，模型組與假手術組相比，模型組的大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少（P＜0.01），丹芪偏癱膠囊給藥組和模型組相比較，穿越平臺的次數(shù)增加（P＜0.05）；給藥4周時，模型組與假手術組相比，模型組大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯較少（P＜0.05），丹芪偏癱膠囊給藥組與模型組相比較，給藥組大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯增多（P＜0.01），以上實驗結(jié)果說明丹芪偏癱膠囊對四動脈結(jié)扎大鼠的記憶能力有明顯的改善作用。

3.2 轉(zhuǎn)棒實驗結(jié)果 轉(zhuǎn)棒實驗主要考察大鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落下來的次數(shù)和在轉(zhuǎn)棒上停留的最長時間，實驗結(jié)果如下所示。

3.2.1 丹芪偏癱膠囊對大鼠掉落次數(shù)的影響的實驗結(jié)果 見表5。為了消除大鼠個體間的差異性，在造模前對大鼠進行了轉(zhuǎn)棒篩選，去除個體差異較大的，選擇個體之間差異性小的大鼠進行下一步實驗。造模前各組之間的掉落次數(shù)差異較小（P＞0.05），而在造模完成后，分別給藥2周和4周的轉(zhuǎn)棒實驗數(shù)據(jù)顯示，模型組與假手術組相比，模型組大鼠的轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)明顯增加（P＜0.01），與丹芪偏癱膠囊給藥組相比，給藥組的掉落次數(shù)明顯下降（P＜0.01），說明丹芪偏癱膠囊能明顯減少由四動脈結(jié)扎所致慢性腦缺血大鼠的轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)，對認知功能具有顯著的改善作用。

表1 丹芪偏癱膠囊對給藥2周后四動脈結(jié)扎大鼠學習能力的影響（±s）Tab.1 Effect of Danqi Piantan capsule on the learning ability of four artery ligation rats after two weeks of administration（±s）s

表1 丹芪偏癱膠囊對給藥2周后四動脈結(jié)扎大鼠學習能力的影響（±s）Tab.1 Effect of Danqi Piantan capsule on the learning ability of four artery ligation rats after two weeks of administration（±s）s

注：與假手術組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù)模型組 10假手術組 10丹芪偏癱膠囊給藥組 10 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 89.08± 2.35** 74.48±21.96** 83.53±7.81** 61.87±27.50 68.97±17.59**47.81±10.56 35.07±16.15 32.44±8.01 36.81± 6.77 22.35± 4.64 61.47±11.89## 39.27±10.23 26.82±6.88## 34.17± 9.86 19.10± 9.47#

表2 丹芪偏癱膠囊對給藥4周后四動脈結(jié)扎大鼠學習能力的影響（±s）Tab.2 Effect of Danqi Piantan capsule on learning ability of the four artery ligation rats after four weeks of administration（±s）s

表2 丹芪偏癱膠囊對給藥4周后四動脈結(jié)扎大鼠學習能力的影響（±s）Tab.2 Effect of Danqi Piantan capsule on learning ability of the four artery ligation rats after four weeks of administration（±s）s

注：與假手術組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù)模型組 10假手術組 10丹芪偏癱膠囊給藥組 10 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 76.23±15.51 72.41±16.85** 53.40±18.25** 51.37±14.07 63.73±22.50**57.31±23.04 29.94± 9.16 20.56± 4.61 28.70± 3.52 24.40± 8.64 70.62±26.21 41.72±11.36## 24.20± 6.91## 38.34± 5.87# 16.48± 4.76##

表3 丹芪偏癱膠囊對四動脈結(jié)扎大鼠平臺象限停留時間的影響（±s）Tab.3 Effect of Danqi Piantan capsule on the quadrant residence time of the four artery ligation rats（±s）s

表3 丹芪偏癱膠囊對四動脈結(jié)扎大鼠平臺象限停留時間的影響（±s）Tab.3 Effect of Danqi Piantan capsule on the quadrant residence time of the four artery ligation rats（±s）s

注：與假手術組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 給藥4周模型組 16.21±5.43#假手術組 26.03±8.75丹芪偏癱膠囊給藥組 37.35±9.95**動物數(shù)10 10 10給藥2周16.95±6.97##39.86±10.47 30.4±7.08**

表4 丹芪偏癱膠囊對四動脈結(jié)扎大鼠穿越平臺次數(shù)的影響（±s）Tab.4 Effect of Danqi Piantan capsule on the number ofcross platform of four artery ligation rats（±s）s

表4 丹芪偏癱膠囊對四動脈結(jié)扎大鼠穿越平臺次數(shù)的影響（±s）Tab.4 Effect of Danqi Piantan capsule on the number ofcross platform of four artery ligation rats（±s）s

注：與假手術組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 4周模型組 1.00±0.98*假手術組 2.17±0.75丹芪偏癱膠囊給藥組 3.00±0.63##動物數(shù)10 10 10 2周1.16±0.75**2.67±0.82 2.33±0.52#

表5 丹芪偏癱膠囊對大鼠掉落次數(shù)的影響（±s）Tab.5 Effect of Danqi Piantan capsule on the number of falling rats（±s） 次

表5 丹芪偏癱膠囊對大鼠掉落次數(shù)的影響（±s）Tab.5 Effect of Danqi Piantan capsule on the number of falling rats（±s） 次

注：與假手術組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別模型組假手術組丹芪偏癱膠囊給藥組動物數(shù)10 10 10造模前 2周 4周4.94±1.89 20.89±4.03**10.67±4.39**5.20±2.00 3.78±1.88 3.05±1.02 4.61±1.91 5.56±0.98## 2.00±0.52##

3.2.2 丹芪偏癱膠囊對大鼠最長停留時間的影響的實驗結(jié)果 見表6。由以上實驗結(jié)果顯示，造模前大鼠在轉(zhuǎn)棒上的最長停留時間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），而在造模完成給藥2周和4周后，模型組與假手術組相比，模型組大鼠的最長停留時間明顯減少（P＜0.05），丹芪偏癱膠囊給藥組與模型組相比，給藥組大鼠在轉(zhuǎn)棒上的最長停留時間明顯增加（P＜0.05），說明丹芪偏癱膠囊能明顯增加慢性腦缺血大鼠在轉(zhuǎn)棒上的最長停留時間，對大鼠的認知功能具有明顯的改善作用。

表6 丹芪偏癱膠囊對大鼠最長停留時間的影響（±s）Tab.6 Effect of Danqi Piantan capsule on the longest residence time in rats（±s）

表6 丹芪偏癱膠囊對大鼠最長停留時間的影響（±s）Tab.6 Effect of Danqi Piantan capsule on the longest residence time in rats（±s）

注：與假手術組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組模型組假手術組丹芪偏癱膠囊給藥組動物數(shù)10 10 10造模前 2周 4周109.5±34.99 30.32±15.04* 19.72± 5.13**99.00±25.30 110.72±42.28 114.11±31.29 104.00±34.79 78.45±28.61##115.78±18.39##

4 討論

認知功能包括學習、記憶、定向能力和思維能力等內(nèi)容，因此評價認知功能的主要指標是學習記憶能力的改善。由于慢性腦低灌注導致認知功能障礙和癡呆的病理生理機制尚未闡明，因而目前亦缺乏特異性的臨床防治措施。近年來，國內(nèi)針對中藥提取物和中藥制劑對腦缺血再灌注后認知功能影響方面的實驗研究越來越多。目前常用的建立慢性腦低灌注大鼠模型的方法有雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法（BCCAO）[9－10]和改良的 Pulsinell[11]四動脈結(jié)扎法等。本實驗采用改良的Pulsinell四動脈結(jié)扎手術[12]，術后大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的缺血，行為學上表現(xiàn)為空間探索能力、學習、認知以及記憶能力顯著下降。此法被國內(nèi)外學者廣泛推崇，是目前復制慢性腦缺血模型的常用方法之一，但此法受動物個體差異的影響較為嚴重，故在實驗模型復制前需對動物做初步的篩選，減少動物之間的個體差異對實驗結(jié)果的影響。

目前評價慢性腦缺血大鼠的學習記憶能力的常用行為學方法有Morris水迷宮實驗、網(wǎng)屏懸掛實驗、轉(zhuǎn)棒實驗、避暗實驗、跳臺實驗等[13－19]。

本實驗采用Morris水迷宮實驗和轉(zhuǎn)棒實驗來評價慢性腦缺血大鼠的學習記憶能力。在水迷宮實驗中，隨著訓練時間以及次數(shù)的增加，大鼠會逐漸學習并記住水中平臺的位置，故到達平臺的時間（逃避潛伏期）會減少，表明大鼠的學習記憶能力的增強。模型組與假手術組及丹芪偏癱膠囊給藥組相比較，模型組大鼠的逃避潛伏期均明顯高于假手術組和丹芪偏癱膠囊給藥組，說明丹芪偏癱膠囊對慢性腦缺血大鼠的學習能力有一定的改善作用。定位航行實驗結(jié)果顯示模型組與假手術組比較到達平臺時間、第一次到達平臺時間均顯著增加，穿越平臺次數(shù)和平臺所在象限停留時間均顯著減少，表明模型組出現(xiàn)了明顯的認知功能障礙。與模型組比較，大鼠穿越平臺的次數(shù)以及在平臺所在象限停留的時間均比假手術組和丹芪偏癱膠囊給藥組大鼠明顯縮短，說明丹芪偏癱膠囊對慢性腦缺血大鼠的記憶能力有一定的改善作用。

在轉(zhuǎn)棒實驗中，隨著訓練學習次數(shù)的增加，大鼠對轉(zhuǎn)棒的轉(zhuǎn)速有了一定的適應記憶能力，故隨著訓練次數(shù)的增加，大鼠的掉落次數(shù)會明顯減少，在轉(zhuǎn)棒上停留的時間會明顯的增加。實驗結(jié)果顯示，模型組與假手術組和丹芪偏癱膠囊給藥組比較掉落次數(shù)顯著增加，最長停留時間均顯著減少，表明模型組出現(xiàn)了明顯的平衡能力障礙。與模型組相比，丹芪偏癱膠囊組可在一定程度上改善大鼠的平衡能力。綜上所述，丹芪偏癱膠囊對四動脈結(jié)扎所致的慢性腦缺血大鼠的學習、記憶等認知功能有一定的保護作用。此結(jié)論提示丹芪偏癱膠囊治療慢性腦缺血可能與其改善認知功能障礙具有一定的關系，具體的作用機制還有待深入研究。