王 莉，楊曉艷

(1.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院口腔科，湖北 武漢 430064； 2.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430064)

奧硝唑?yàn)榈?代硝基咪唑類衍生物，具有良好的抗厭氧菌和抗滴蟲作用，國(guó)內(nèi)有奧硝唑片劑、膠囊、乳膏及栓劑等劑型，多用于口腔科、婦產(chǎn)科等疾病的治療，其中用于口腔科的制劑種類較少，僅有片劑、溶液劑和糊劑等常規(guī)制劑，需要1日給藥數(shù)次，且血藥濃度的波動(dòng)較大，胃腸道不良反應(yīng)較多[1-2]。因此，本研究制備了奧硝唑溫敏微乳凝膠，其釋藥周期長(zhǎng)，所用輔料為可生物降解材料，本身及其降解產(chǎn)物均對(duì)人體無(wú)毒[3]，使用時(shí)可直接作用于口腔炎癥部位，較長(zhǎng)時(shí)間恒定維持有效藥物濃度，避免全身給藥所致諸多不良反應(yīng)，達(dá)到清除致病因子、安全簡(jiǎn)便、有效治療口腔疾病的目的。

1 材料

1.1 儀器

LC-10Atvp型高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外檢測(cè)器，島津class-vp色譜工作站(日本島津公司)；TG-328光學(xué)讀數(shù)分析天平(湘儀天平儀器廠，感量0.1 mg)；超聲波溶解儀(上海寧商超聲儀器有限公司)；低速臺(tái)式離心機(jī)(上海市離心機(jī)廠研究所)；SHZ-82型恒溫振動(dòng)器(常州國(guó)華電器有限公司)；恒溫加熱磁力攪拌儀(常州國(guó)華電器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

奧硝唑原料(湖北欣瑩合醫(yī)藥原料有限公司，批號(hào)：20161017，含量>99.6%)，奧硝唑片(四川科倫制藥廠，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030148，批號(hào)：20170305，規(guī)格：0.25 g/片)，奧硝唑標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100522-201003，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)；泊洛沙姆 P407、P188(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20151101)，聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30，山東聊城阿華制藥有限公司，批號(hào)：20151227)，卡波姆934(北京市海淀會(huì)友精細(xì)化工廠，批號(hào)：20150921)，羥丙基甲基纖維素(HPMC K4M，河南天盛化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào)：20110925)。

2 方法與結(jié)果

奧硝唑微溶于水，易溶于氯仿和乙醇[4]，先將其制成油包水(W/O)型微乳液，再與適宜的溫敏凝膠基質(zhì)制成微乳凝膠。

2.1 奧硝唑微乳液的制備

微乳液由油相、水相和混合乳化劑(乳化劑+助乳化劑)組成，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，以14%丙二醇辛酸酯(Capryol 90)為油相，33.5%聚氧乙烯-35-蓖麻油(EL-35)為乳化劑，10%丙二醇為助乳化劑，所得到的微乳液澄明度較好，并且粒徑較小、分布均勻。具體方法為：首先將奧硝唑2.0 g加入至丙二醇10 ml中至完全溶解，然后與Capryol 90 14.0 g攪拌均勻，再加入乳化劑EL-35 33.5 g，在攪拌器(1 000 r/min)中攪拌直至成為均勻液體，加入蒸餾水至100.0 g，在攪拌器(1 000 r/min)中沿同一方向攪拌直至成為微乳液。

2.2 溫敏凝膠的制備

2.2.1 溫敏凝膠基質(zhì)的選擇：目前常用的溫敏凝膠基質(zhì)有泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、殼聚糖及聚乙交酯丙交酯-聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯(PLGA-PEG-PLGA)等[5-6]。通過(guò)攪拌子轉(zhuǎn)運(yùn)法[7]進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，泊洛沙姆188、殼聚糖及PLGA-PEG-PLGA3原位凝膠材料相變溫度范圍大，不易控制用量，且單純的殼聚糖溫度敏感凝膠力學(xué)強(qiáng)度較低，在體溫下凝膠形成的速度不易控制，故選用泊洛沙姆407作凝膠基質(zhì)與奧硝唑微乳液進(jìn)行研究。

2.2.2 泊洛沙姆407用量的確定：溫敏凝膠中奧硝唑的含量為0.5%，采用單因素考察泊洛沙姆407用量對(duì)載藥凝膠相變溫度的影響，確定泊洛沙姆407的最佳用量。精密稱取泊洛沙姆適量，加入奧硝唑微乳液和蒸餾水至1 000 ml，制成溫敏微乳凝膠，按攪拌子轉(zhuǎn)運(yùn)法測(cè)定相變溫度，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，泊洛沙姆407凝膠相變溫度與泊洛沙姆407用量呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)在泊洛沙姆407溶液中加入奧硝唑微乳后，溫敏凝膠的相變溫度有顯著性提高，泊洛沙姆的用量過(guò)高或過(guò)低對(duì)溫敏凝膠的制備及質(zhì)量影響較大。根據(jù)口腔內(nèi)溫度，本研究選擇泊洛沙姆407用量為37%，相變溫度在36～38 ℃范圍內(nèi)的A7組作進(jìn)一步研究。

表1 泊洛沙姆用量篩選表(n=6)Tab 1 Poloxamer dosage screening(n=6)

注：“—”表示不含微乳液，“q.s”表示適量

Note：“—”express excluding microemulsion，“q.s”express a moderate amount

2.2.3 黏膜黏附劑的選擇：溫敏微乳凝膠不僅需要具有適宜的相變溫度，使其能在人體生理溫度內(nèi)發(fā)生相轉(zhuǎn)變，而且應(yīng)具有合適的黏附性，經(jīng)口腔給藥后不會(huì)從口腔黏膜上脫落[8]。在確定泊洛沙姆407和奧硝唑微乳液的用量后，選用不同的高分子黏膜黏附劑進(jìn)行黏附力大小比較，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，隨著高分子黏膜黏附劑用量的增加，微乳凝膠的黏附力增大，而相變溫度卻顯著降低。以卡波姆934作黏附劑時(shí)相變溫度過(guò)低，而HPMC K4M作黏附劑時(shí)黏附力太大，均不符合要求。查閱相關(guān)資料，口腔內(nèi)溫度為37 ℃[9]，綜合相變溫度和黏附力的指標(biāo)，選用B4組作為適宜處方制備奧硝唑溫敏微乳凝膠。

表2 黏附劑種類和用量篩選(n=6)Tab 2 The kind and amount of adhesion agent screening(n=6)

注：“—”表示不含黏附劑，“q.s”表示適量

Note：“—”express excluding adhesion agent，“q.s”express a moderate amount

2.3 溫敏微乳凝膠的制備

取奧硝唑微乳液250 g、PVP K30 10.0 g和尼泊金5.0 g溶于適量蒸餾水中，將該溶液冷卻至4 ℃；然后緩慢加入泊洛沙姆407，邊加邊攪拌，最后蒸餾水加至1 000 g，將混合物放置于4 ℃下過(guò)夜，得無(wú)色透明黏液，即為奧硝唑溫敏型微乳凝膠。分裝于密閉容器中，貯存于陰涼處。

2.4 含量測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定微乳凝膠中奧硝唑的含量[10]。

2.4.1 色譜條件：色譜柱為大連依利特C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(V∶V=35∶65)，流速為1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為318 nm，操作溫度為室溫(25 ℃)，進(jìn)樣量為20 μl。

2.4.2 線性關(guān)系考察：取奧硝唑?qū)φ掌芳s50 mg，精密稱定，置于50 ml容量瓶，以流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取上述溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0及8.0 ml，置于10 ml容量瓶，以流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，按照“2.4.1”項(xiàng)下條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以?shī)W硝唑峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=0.397 9X+0.122 5，r=0.999 2，表明奧硝唑在25.0～800.0 μg/ml 范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。同法作空白實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

A.空白凝膠基質(zhì)溶液；B.標(biāo)準(zhǔn)品溶液A. blank gel matrix solution; B. standard solution圖1 奧硝唑高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of omidazole

2.4.3 樣品含量測(cè)定：精密稱取奧硝唑溫敏微乳凝膠1 g，置于50 ml容量瓶，加流動(dòng)相40 ml水浴微溫溶解，放置于室溫后加流動(dòng)相至刻度，搖勻后濾膜過(guò)濾，精密量取20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，3批樣品含量分別為101.21%、102.75%和100.33%，RSD分別為0.87%(n=3)、0.69%(n=3)和0.92%(n=3)。

2.5 凝膠性質(zhì)考察

2.5.1 體外釋放度測(cè)定：采用動(dòng)態(tài)膜透析法測(cè)定微乳凝膠中奧硝唑的體外釋放量，并用市售普通片劑進(jìn)行平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)[11]。分別稱取微乳凝膠10 g和奧硝唑片2片置于透析袋中，袋內(nèi)加入pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)2 ml后封口，將透析袋置于盛有PBS 50 ml的具塞三角瓶中，在(37±0.5)℃的恒溫振動(dòng)器中振動(dòng)(100 r/min)，于0、0.5、1、2、4、8、12及24 h分別取樣1 ml并補(bǔ)充同量同溫的釋放介質(zhì)，按照“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定奧硝唑百分含量并計(jì)算藥物累積釋放量。結(jié)果表明，微乳凝膠中奧硝唑在2 h前快速釋放，2 h后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，然后緩慢持續(xù)釋放，8 h達(dá)到累積釋放度87.50%，藥物釋放基本完全；而片劑中奧硝唑8 h累積釋放度為60.34%，釋放較慢且不完全，片劑累積釋放度較微乳凝膠低，8 h內(nèi)兩者的累積釋放度有顯著性差異(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 奧硝唑微乳凝膠和片劑的體外累積釋放度(n=5)Fig 2 Cumulative release in vitro of microemulsion-based gels and tables of omidazole(n=5)

2.5.2 體外黏附力的測(cè)定：采用自制的黏附力測(cè)定裝置，對(duì)奧硝唑微乳凝膠進(jìn)行黏附力的測(cè)定[12]。結(jié)果表明，PVP K30組均能形成黏度合適的微乳凝膠制劑，而HPMC K4M組形成的微乳凝膠黏度過(guò)低，不適合于口腔黏膜的局部用藥要求，見(jiàn)表3。

表3 奧硝唑微乳凝膠體外黏附力測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab 3 The adhesion strength in vitro determination results of microemulsion-based gel of omidazole(n=3)

2.5.3 穩(wěn)定性研究：(1)離心實(shí)驗(yàn)。取奧硝唑微乳凝膠樣品3批各10 g，裝入離心管中，在3 000 r/min下離心30 min，微乳凝膠無(wú)分層、破乳現(xiàn)象出現(xiàn)。(2)光照實(shí)驗(yàn)。取奧硝唑微乳凝膠樣品3批，在光照強(qiáng)度4 500 Lx條件下進(jìn)行光照實(shí)驗(yàn)，于不同時(shí)間取樣測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表4。(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)。評(píng)估在3種存儲(chǔ)條件(25 ℃/60% RH、30 ℃/65% RH和40 ℃/75% RH)下奧硝唑微乳凝膠的穩(wěn)定性，時(shí)間為3個(gè)月，含量測(cè)定方法同“2.4”，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，隨著溫度的升高或貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物降解率增加，奧硝唑的百分含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有下降的趨勢(shì)，但均無(wú)分層、絮凝及破乳現(xiàn)象出現(xiàn)。因此，奧硝唑微乳凝膠可在室溫環(huán)境下貯存保管，但應(yīng)有一定的貯存期限。

表4 奧硝唑微乳凝膠穩(wěn)定性結(jié)果(n=3)Tab 4 Stability results of microemulsion-based gel of omidazole(n=3)

3 討論

泊洛沙姆溶液具有反向膠凝的特性，當(dāng)溫度升高時(shí)可由溶液狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，機(jī)理是泊洛沙姆分子在水溶液中形成以疏水性聚氧丙烯(PPO)為內(nèi)核，以親水性聚氧乙烯(PEO)為外殼的球狀膠束[13]，當(dāng)溫度升高至膠凝溫度時(shí)，膠束間相互纏結(jié)和堆積，從而形成半固體狀的凝膠[14]，是目前常用的溫度敏感型高分子材料。

乳劑型凝膠含有水、油、表面活性劑和凝膠基質(zhì)，當(dāng)局部應(yīng)用黏膜給藥時(shí)，藥物的藥時(shí)曲線下面積有很大提高[15]。奧硝唑微乳凝膠在室溫下為液態(tài)，滴入口腔內(nèi)溫度升高，可在給藥部位發(fā)生相轉(zhuǎn)變形成半固體凝膠，兼具了微乳和凝膠2種劑型的優(yōu)點(diǎn)，微乳中的奧硝唑能被快速釋放，而凝膠能延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，發(fā)揮一定的緩釋作用，可提高藥物療效。