劉 丹 陳國(guó)福 劉永慶 裴寶瑞 劉 斌

(唐山市豐潤(rùn)區(qū)人民醫(yī)院骨科，河北 唐山 063000)

骨肉瘤惡性程度高，骨肉瘤的轉(zhuǎn)移率及病死率高，確診患者有50%以上不同程度的肺部轉(zhuǎn)移。雖然目前對(duì)骨肉瘤的治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等問(wèn)題仍然沒(méi)有有效解決，骨肉瘤患者伴有肺部轉(zhuǎn)移生存率沒(méi)有明顯提高〔1〕。在基因治療中尋求有效的治療靶點(diǎn)成為急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9是鋅離子依賴性蛋白水解酶家族成員之一，主要具有降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜的能力，降解基底膜的蛋白——Ⅳ型膠原〔2〕，并能促進(jìn)血管生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附性，促進(jìn)細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)〔3〕，其在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。研究表明MMP-9在骨肉瘤中存在過(guò)度表達(dá)的現(xiàn)象〔4〕。本研究選取MMP-9作為靶基因來(lái)研究其對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞侵襲、遷移的作用。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株由華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；10%胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)置于美國(guó)Gibco公司；慢病毒載體購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，shRNA-MMP-9陽(yáng)性序列：5′-UCCAGGGCGAGGACCAUAGAG-3′。shRNA-MMP-9陰性對(duì)照序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAGTCT-3′；RT-PCR實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；Matrigel 購(gòu)置于BD公司。Transwell小室購(gòu)置于BI公司；MMP-9和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)一抗體和二抗體均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 骨肉瘤MG-63細(xì)胞用含10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)可進(jìn)行消化傳代。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為：轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染shRNA-MMP-9序列)、對(duì)照組(轉(zhuǎn)染shRNA-MMP-9-NC序列)、空白組〔磷酸鹽緩沖液(PBS)〕。轉(zhuǎn)染操作參照吉?jiǎng)P慢病毒轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)染48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率。

1.4RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，參照Trizol說(shuō)明書(shū)一步法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度復(fù)合實(shí)驗(yàn)要求后，用M-MLV試劑盒將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA后，再使用SYBR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物序列MMP-9為上游：5′-CTGTTGGACTGCTGCTTTGCTG-3′；下游：5′-GTCTCCTGAAAGGTTTGGAAT-3′。β-actin為上游5′-GTTGGGACCTGAGAGACTA-3′；下游：5′-TGGCGATGTCCAGTCACACT-3′。擴(kuò)增條件：93℃預(yù)變性10 min，93℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10 min。采用相對(duì)定量的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，每組樣品取50 μg蛋白質(zhì)/泳道，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，進(jìn)行電轉(zhuǎn)，設(shè)置250 mA 90 min將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；分別滴加150 μl一抗miR-143(1∶1 000)和MMP-13(1∶2 000)及一抗β-actin(1∶1 000)，4℃過(guò)夜；三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBST)洗滌10 min×3次；加入100 μl二抗(1∶1 000)，37℃孵育1.5 h；TBST洗膜10 min×3次。進(jìn)行顯色，掃描條帶，Image J軟件分析光密度值。

1.6Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將4℃過(guò)夜Matrigel和4℃預(yù)冷改良Eagle培養(yǎng)液(DMEM)按照1∶8比例進(jìn)行混勻后，鋪加在小室上室面，37℃孵育30 min，使Matrigel聚合成凝膠狀態(tài)，制備Transwell小室。各組細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化，稀釋細(xì)胞濃度至5×105/ml，滴加150 μl/孔至小室的上室，下室中加入含20% FBS的完全培養(yǎng)液600 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸掉上層小室的培養(yǎng)液并用棉簽輕柔擦拭Matrigel膠及沒(méi)有穿透的細(xì)胞，將聚碳酸酯膜小心的切取下來(lái)，常規(guī)進(jìn)行蘇木素染色，中性樹(shù)膠封片。在200倍的光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取出5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)在每個(gè)視野中穿出膜的細(xì)胞數(shù)目，取其平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，以此作為評(píng)估各組細(xì)胞侵襲能力的指標(biāo)。

1.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 采用Marker筆在6孔板背面畫(huà)出均勻間隔0.8 cm左右的橫線，橫穿過(guò)孔，每孔至少穿過(guò)5條線。各組細(xì)胞常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml。細(xì)胞融合率達(dá)到100%時(shí)用10 μl的槍頭作劃痕，劃痕完畢后，PBS輕洗細(xì)胞3次，漂洗去除劃下的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。按0，24，48 h時(shí)間點(diǎn)取樣，拍照，用Image J軟件分析培養(yǎng)0、48 h時(shí)的各組劃痕情況。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析，組間比較使用SNK法。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染率 利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，根據(jù)最強(qiáng)紅色熒光判斷轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染率可達(dá)90%以上，證實(shí)慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染率高。見(jiàn)圖1。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率(×400)

2.2MMP-9和VEGF的mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染組MMP-9 和VEGF的mRNA表達(dá)水平相比于對(duì)照組和空白組顯著降低(P<0.05)，而對(duì)照組和空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組MMP-9和VEGF mRNA表達(dá)

與對(duì)照組和空白組比較：1)P<0.05，下表同

2.3MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染組MMP-9、VEGF蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組及空白組(P<0.05)；空白組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測(cè)MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá)

組別MMP-9VEGF轉(zhuǎn)染組0.175±0.2261)0.152±0.1051)對(duì)照組0.328±0.0150.338±0.312空白組0.343±0.6030.356±2.205F/P值6.52/0.005.86/0.00

2.4細(xì)胞的侵襲能力 各組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為：轉(zhuǎn)染組(56.37±3.29)個(gè)/視野、對(duì)照組(92.06±3.56)個(gè)/視野，空白組(93.05±1.52)個(gè)/視野；與空白組和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，空白組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力(蘇木精染色，×200)

2.5細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力 轉(zhuǎn)染組、對(duì)照組和空白組劃痕愈合率分別為23.63%±1.47%、57.17%±3.86%、58.13%±2.35%；空白組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，轉(zhuǎn)染組明顯小于對(duì)照組及空白組(P<0.05)。

3 討 論

骨肉瘤惡性程度高，好發(fā)于兒童及青少年，發(fā)生轉(zhuǎn)移早，預(yù)后差，腫瘤新生微血管的形成和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解是骨肉瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；啄ず虴CM是抵御和抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的天然屏障。惡性腫瘤在局部侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，癌細(xì)胞必須具備降解ECM和基底膜的生物學(xué)能力。MMPs是鋅離子依賴蛋白水解酶，能降解ECM成分，與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、血管形成關(guān)系十分密切〔5〕。MMPs在腫瘤中呈高表達(dá)，在促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中有重要作用。一方面通過(guò)激活和釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子而促進(jìn)腫瘤血管的生成，另一方面通過(guò)降解ECM而降低微血管生成的壓力〔6〕。MMP-9是MMPs家族成員之一，屬于Ⅳ型膠原酶，MMP-9是消化降解Ⅳ型膠原最關(guān)鍵的酶，主要參與基質(zhì)的降解和再塑，并且與間質(zhì)血管關(guān)系密切，調(diào)控腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力〔7〕。MMP-9通過(guò)直接或間接降解基底膜和ECM成分調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的黏附，激活具有活性的酶等作用來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔8〕。MMP-9在多種惡性腫瘤呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與該腫瘤的血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等密切相關(guān)〔9〕。研究表明，MMP-9在骨肉瘤組織中表達(dá)顯著增高，而且其與骨肉瘤的惡性程度、局部浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)〔4〕，是臨床評(píng)價(jià)該病患者治療效果的重要指標(biāo)〔10〕。

骨肉瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管形成是一個(gè)多階段、多基因參與的復(fù)雜過(guò)程。血管生成相關(guān)因子在骨肉瘤組織直徑超過(guò)2 mm，新生微血管的形成過(guò)程中起著決定性作用。VEGF是目前作用最強(qiáng)、研究最清楚的一種多功能促進(jìn)腫瘤的血管生長(zhǎng)因子，通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體特異性結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞變異、運(yùn)動(dòng)、遷徙、增加血管通透性及血漿蛋白滲出等促進(jìn)腫瘤血管生成作用。由于新生微血管基底膜缺損，通透性大，癌細(xì)胞易侵入血管，發(fā)生局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。另外VEGF還可以通過(guò)增加ECM促進(jìn)腫瘤血管形成，也可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，起到促進(jìn)細(xì)胞分裂、改變細(xì)胞形態(tài)及遷移血管構(gòu)建的作用〔11〕。李瑞玲〔12〕采用免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中MMP-9和VEGF的表達(dá)量明顯高于良性骨腫瘤組織，并且與骨肉瘤臨床分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)，說(shuō)明骨肉瘤中MMP-9和VEGF表達(dá)明顯上調(diào)，與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

RNA干擾(RNAi)是最近幾年新興的基因沉默技術(shù)，是將shRNA或siRNA通過(guò)載體介導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到其發(fā)揮沉默基因的作用，由于shRNA比siRNA作用更高效、穩(wěn)定，因此目前大部分被設(shè)計(jì)成shRNA。RNAi具有抑制率高，易篩選靶序列，效率高等特點(diǎn)，已應(yīng)用于基因功能研究及腫瘤疾病的基因治療等。

本研究說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。利用RNA干擾技術(shù)沉默MMP-9，通過(guò)作用于VEGF，可降低骨肉瘤MG-63細(xì)胞的侵襲和遷移能力。有研究設(shè)計(jì)合成針對(duì)MMP-9的siRNA利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞SGC7901發(fā)現(xiàn)靶向MMP-9的siRNA不僅能特異性降低MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)，且能抑制胃腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移〔13〕。胡娜等〔14〕利用siRNA干擾黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞B16F10的MMP-9和FAK雙基因，發(fā)現(xiàn)可抑制小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)和在體遷移。Mei等〔15〕應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默骨肉瘤細(xì)胞VEGF發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖與浸潤(rùn)明顯受到抑制，王家琪等〔16〕將攜帶siRNA-VEGF的骨肉瘤細(xì)胞導(dǎo)入裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤微血管密度、體積及重量受到抑制。

利用RNA干擾技術(shù)沉默基因可調(diào)控骨惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥性等，shRNA在骨肉瘤的基因靶向治療中顯示出良好的應(yīng)用前景。然而，關(guān)于shRNA誘導(dǎo)基因沉默在惡性骨腫瘤中的研究比較局限，許多研究仍然處于基礎(chǔ)探索研究階段，如何與臨床治療相結(jié)合則需要進(jìn)一步研究。隨著對(duì)shRNA誘導(dǎo)基因沉默在骨肉瘤研究中的不斷深入，shRNA誘導(dǎo)基因沉默有望成為骨肉瘤臨床治療的有效手段。