李璟 蔣娜 王晶晶 馬興建 王家賓

摘 要：目的 觀察右美托咪定對H9C2心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用。方法 H9C2心肌細胞隨機分為三組：正常對照組（Control）、缺氧/復氧組（H/R）、Dex（5 μmol/L）干預H/R組。Dex干預H/R組先用Dex預處理6 h后，再經(jīng)缺氧/復氧處理。采用倒置顯微鏡觀察各組H9C2心肌細胞形態(tài)的變化，檢測各組細胞培養(yǎng)基中LDH的含量，CCK-8法檢測各組H9C2心肌細胞的存活率，試劑盒檢測caspase-3活性，TUNEL法檢測細胞凋亡并計算凋亡指數(shù)。結(jié)果 與Control組相比，H/R組細胞皺縮，大量死亡，細胞活力降低，培養(yǎng)基中LDH含量增加，caspase-3活性增加，細胞凋亡指數(shù)增加，統(tǒng)計學意義顯著（P<0.01）；Dex預處理可明顯改善H/R處理后細胞形態(tài)，提高細胞活力，減少LDH含量和caspase-3活性，降低細胞凋亡指數(shù)，統(tǒng)計學意義顯著（P<0.01）。結(jié)論 Dex可通過減少H9C2心肌細胞缺氧/復氧引起的細胞凋亡減輕損傷。

關(guān)鍵詞：右美托咪定；H9C2；缺氧/復氧；細胞凋亡

中圖分類號：R917 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.09.025

文章編號：1006-1959（2018）09-0083-04

Abstract：Objective To observe the protective effects of dexmedetomidine on hypoxia/reoxygenation injury of H9C2 cardiomyocytes. Methods H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into three groups： normal control group（Control），hypoxia/reoxygenation group （H/R）and Dex（5μmol/L）intervention group.Dex intervention in group H/R was treated with Dex pretreatment for 6 h before anoxia/ reoxygenation.The morphologic changes of H9C2 cardiomyocytes in each group were observed by inverted microscope.The content of LDH in the cell culture medium of each group was detected.The survival rate of H9C2 cardiomyocytes in each group was detected by CCK-8 method.The activity of caspase-3 was detected by the kit.The apoptosis was detected by TUNEL method and the apoptosis index was calculated.Results Compared with the Control group，the cells in the H/R group were shrinking，a large number of deaths， the decrease of cell vitality，the increase of LDH content in the medium，the increase of the activity of caspase-3，the increase of the apoptosis index，and the significant statistical significance（P<0.01）.Dex pretreatment could obviously improve the morphology of the cells after H/R treatment，raise the vitality of the cells，reduce the content of LDH and caspase-3 activity decreased the apoptotic index，and the difference was statistically significant（P<0.01）.Conclusion Dex can reduce the injury of H9C2 cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation.

Key words：Dexmedetomidine；H9C2；Hypoxia/Reoxygenation；Apoptosis

缺血性心臟病是導致死亡的一類主要的心血管疾病，嚴重危害人類健康，及時有效的恢復缺血心肌的血流-即再灌注，是臨床治療的首選，然而缺血心肌恢復血流的同時會加重心肌損傷和能量代謝障礙，形成心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）[1-3]。右美托咪定（dexmedetomidine， Dex）是一種新型的高選擇性α2受體激動劑，被廣泛應用于心血管手術(shù)的麻醉，并收到了較好的效果。Dex在心血管疾病中發(fā)揮保護作用，但具體機制仍不清楚。Dex具有劑量依賴性的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑制交感神經(jīng)興奮等作用，且對呼吸、循環(huán)的抑制作用輕微[8-10]。Dex對心肌的保護作用受到越來越多的關(guān)注，普遍認為Dex是通過抑制交感中樞活動，降低心率，降低心肌氧耗，改善心肌氧供需平衡，但具體機制仍未闡明。本研究采用H9C2心肌細胞缺氧/復氧模型，觀察Dex預處理對缺氧/復氧損傷的影響及其可能機制，現(xiàn)分析如下。

1材料與方法

1.1材料與儀器 H9C2心肌細胞系購買自深圳百恩維公司；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司；0.25 %胰蛋白酶購自Sigma公司；鹽酸右美托咪定購自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司（200 μg/2 ml）；CCK-8細胞毒性檢測試劑盒購自七海生物公司；LDH檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，抗Bcl2、抗Bax和抗GAPDH抗體均購自Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備儀器廠；CO2細胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司；低速離心機購自賽特湘儀公司；Western-blot相關(guān)儀器均購自Bio-Rad公司；酶標儀購自SpectraMax公司。

1.2 H9C2心肌細胞的培養(yǎng)和H/R模型的建立用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育H9C2細胞；H/R模型通過將H9C2細胞正常培養(yǎng)基換為無血清的DMEM并在缺氧箱中處理12 h，之后將無血清的DMEM換成含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液后放入正常培養(yǎng)箱中孵育4 h。

1.3 實驗分組將H9C2細胞隨機分為三組：正常對照組（Control）、缺氧/復氧組（H/R）和右美托咪定干預缺氧/復氧組（Dex+H/R）。Dex+H/R 組先用Dex預處理6 h，再進行H/R處理。

1.4 CCK-8法檢測各組細胞活力各組實驗結(jié)束后，將培養(yǎng)基倒掉，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，再加入100 μl無血清的培養(yǎng)液和10 μl CCK-8檢測液，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，酶標儀檢測各孔OD值，波長為450 nm。

1.5 各組細胞培養(yǎng)液中LDH的檢測各組實驗結(jié)束后，收集每組培養(yǎng)瓶中細胞培養(yǎng)液，嚴格按照南京建成生物工程研究所提供的檢測試劑盒說明書操作，酶標儀檢測各孔OD值，波長為450 nm，將各組讀數(shù)與Control組比較。

1.6 TUNEL法檢測細胞凋亡各組實驗結(jié)束后，用PBS清洗3次，10 min/次；用0.1 %的Triton-X室溫破膜10 min，再用PBS洗3次，10min/次；按照TUNEL試劑盒說明，將1號液和2號液按1：9混合，37 ℃水浴避光孵育2 h；再用PBS洗3次，10 min/次，DAPI染液避光染核37 ℃水浴10 min，再用PBS洗3次，10 min/次。激光共聚焦顯微鏡拍照，細胞凋亡指數(shù)=綠色細胞核數(shù)/藍色細胞核數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計學處理采用Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果用（x±s）表示，用單因素方差分析比較兩組之間的統(tǒng)計學差異，并用Bonferroni法進行校正，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示統(tǒng)計學意義顯著。

2結(jié)果

2.1 Dex對H/R損傷后H9C2細胞活力的影響與Control組相比，H/R處理后降低H9C2細胞活力（P<0.01），倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞皺縮，大量死亡；與H/R組相比，Dex干預H/R組細胞活力得到改善（P<0.01），細胞皺縮減輕，死亡減少，見圖1。

2.2 Dex對H/R損傷后H9C2細胞培養(yǎng)液中LDH含量的影響與Control組相比，H/R處理后培養(yǎng)液中LDH含量升高（P<0.01）；與H/R組相比，Dex干預H/R組培養(yǎng)液中LDH含量降低（P<0.01），見圖2。

2.3 Dex對H/R損傷后H9C2細胞caspase-3活性的

影響與Control組相比，H/R處理后培養(yǎng)液中LDH含量升高（P<0.05）；與H/R組相比，Dex干預H/R組培養(yǎng)液中LDH含量降低（P<0.05），見圖3。

2.4 Dex對H/R損傷后H9C2細胞凋亡的影響與Control組相比，H/R處理后細胞凋亡增加，凋亡指數(shù)增大（P<0.01）；與H/R組相比，Dex干預H/R組后細胞凋亡減少，凋亡指數(shù)降低（P<0.01），見圖4。

3討論

心臟缺血/再灌注損傷已經(jīng)成為制約缺血性心臟病患者預后的重要因素，極大的限制了臨床上藥物溶栓、動脈搭橋術(shù)和經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)等的治療效果。如何有效減輕缺血/再灌注損傷成為了心血管研究領(lǐng)域的焦點。Dex作為一種新型的α腎上腺素受體高選擇性激動劑，具有劑量依賴性的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑制交感神經(jīng)興奮等作用，且對呼吸、循環(huán)的抑制作用輕微 [4-6]。Dex對心肌的保護作用受到越來越多的關(guān)注，普遍認為Dex是通過抑制交感中樞活動，降低心率，降低心肌氧耗，改善心肌氧供需平衡，但具體機制仍未闡明。

以往研究表明，Dex預處理可激活α腎上腺素能受體，減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷。Dex還可能通過抑制mPTP的開放及線粒體ATP敏感性鉀通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel， mitoKATP）的活性減少心肌損傷[4，7]。細胞凋亡是心肌細胞損傷的重要機制，是由基因控制的程序化死亡過程[4]。有研究證實，細胞凋亡是缺血再灌注損傷中細胞死亡的主要方式[8，9]。H9C2細胞系是大鼠胚胎心肌組織的亞克隆細胞株，可用于模擬心肌細胞的各種病理模型，在心肌保護的機制研究中發(fā)揮重要作用[10，11]。線粒體途徑在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，caspase-3是caspase家族中關(guān)鍵的效應分子，其活性增加是線粒體凋亡發(fā)生的重要標志[12，13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在H9C2心肌細胞H/R時，細胞皺縮，大量死亡，LDH釋放增多，caspase-3活性明顯增加，而Dex預處理后，可明顯減少細胞死亡和LDH釋放，抑制caspase-3活性。這些結(jié)果說明，Dex可通過抑制細胞凋亡減輕H9C2心肌細胞H/R損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，Dex預處理可明顯減少細胞凋亡從而減輕心肌缺血/再灌注損傷，然而Dex減少細胞凋亡是否依賴于線粒體，Dex減輕心肌缺血/再灌注損傷有無其它的作用靶點，相關(guān)的機制仍未闡明，具體信號分子有待進一步的研究。

綜上所述，本研究證實Dex可通過減少細胞凋亡在心肌細胞缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要保護作用，是一種潛在的缺血/再灌注心肌保護藥物。本研究為臨床上應用Dex干預心血管疾病提供了實驗依據(jù)。但具體的信號機制有待深入的研究。

參考文獻：

[1]Hausenloy DJ，Yellon DM.Myocardial ischemia-reperfusion injury：a neglected therapeutic target[J].J Clin Invest，2013，123（1）： 92-100.

[2]Hausenloy DJ，Yellon DM.Ischaemic conditioning and reperfusion injury[J].Nat Rev Cardiol，2016，13（4）：193-209.

[3]Morciano G，Giorgi C，Bonora M，et al.Molecular identity of the mitochondrial permeability transition pore and its role in ischemia-reperfusion injury[J].J Mol Cell Cardiol，2015（78）：142-153.

[4]姜翠翠，夏滿莉，王敏，等.右美托咪定預處理減輕離體大鼠心臟缺血/再灌注損傷的線粒體相關(guān)機制[J]. 浙江大學學報（醫(yī)學版），2013，42（3）：326-330.

[5]Guler L，Bozkirli F，Bedirli N，et al.Comparison of the effects of dexmedetomidine vs.Ketamin in cardiac ischemial reperfusion injury in rat-preliminary study[J].Adv Clin Exp Med，2014，23（5）：683-689.

[6]Devasya A，Sarpangala M.Dexmedetomidine：a review of a newer sedative in dentistry[J].J Clin Pediatr Dent，2015，39（5）：401-409.

[7]Terashima Y，Sato T，Yano T，et al.Roles of phospho-GSK-3β in myocardial protection afforded by activation of the mitochondrial K ATP channel[J].J Mol Cell Cardiol，2010，49（5）：762-770.

[8]Takemura G，Kanoh M，Minatoquchi S，et al.Cardiomyocyte apoptosis in the failing heart-a critical review from definition and classification of cell death[J].Int J Cardiol，2013，167（6）： 2373-2386.

[9]Zhang C，Huang Z，Gu J，et al.Fibroblast growth factor 21 protects the heart from apoptosis in a diabetic mouse model via extracellular signal-regulated kinase 1/2-dependent signalling pathway[J].Diabetologia，2015，58（8）：1937-1948.

[10]Wang X，Zhang Y，Wang H，et al.MicroRNA-145 aggravates hypoxia-induced injury by targeting Rac1 in H9c2 cells[J].Cell Physiol Biochem，2017，43（5）：1974-1986.

[11]Salani B，Ravera S，F(xiàn)abbi P，et al.Glibenclamide mimics metabolic effects of metformin in H9c2 cells[J].Cell Physiol Biochem，2017，43（3）：879-890.

[12]Major JL，Salih M，Tuana BS.E2F6 protein levels modulate drug induced apoptosis in cardiomyocytes[J].Cell Signal，2017（40）：230-238.

[13]Qian ZQ，Wang YW，Li YL，et al.Icariin prevents hypertension-induced cardiomyocyte apoptosis through the mitochondrial apoptotic pathway[J].Biomed Pharmacother，2017（88）：823-831.

收稿日期：2017-11-8；修回日期：2017-11-14

編輯/李樺