任明明，韓振，陳立波，李敬來(lái)，馮鋼，許志鋒，黃磊，歐陽(yáng)春

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036）

心血管疾病是當(dāng)今威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，高居致死病因的首位[1]。由于成年心肌細(xì)胞不具有再生性，因此，在心肌壞死的治療過(guò)程中，心臟移植成為重要的治療手段[2]。人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells,hESCs）是心臟再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有希望的細(xì)胞源，其具有無(wú)限分化的能力和增殖能力，從hESCs衍化生成的心肌細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞移植取代病損心肌而恢復(fù)心臟功能。優(yōu)化心肌細(xì)胞分化的方法，從而獲得足夠數(shù)量和純度的心肌細(xì)胞是進(jìn)行細(xì)胞移植治療的關(guān)鍵[3-5]。

心臟發(fā)育是精密且細(xì)致的過(guò)程[6]。然而如何實(shí)現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化為均一的心肌細(xì)胞仍然充滿挑戰(zhàn)。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，逐漸成為生物醫(yī)學(xué)研究的新型熱點(diǎn)，其中介孔納米二氧化硅（mesoporous silica nanoparticles,MSN）作為一種納米藥物輸送載體，在體外研究中得到了更廣泛的應(yīng)用[7-8]。本研究采用優(yōu)化的介孔二氧化硅納米輸送體系作為誘導(dǎo)劑，探討體外誘導(dǎo)hESCs定向心肌分化可行性及其可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

hESCs（X-01系）購(gòu)自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

硅酸四乙酯（tetraethyl orthosilicate,TEOS）、氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyl trimethoxysilane,APTES）、十六烷基三甲基溴化銨（cetrimonium bromide,CTAB）、乙醇、氫氧化鈉（sodium hydroxide,NaOH）、 四 甲 基 羅 丹 明（tetramethyl rhodamine,TRITC） 鹽 酸（hydrochloric acid,HCl）、 抗 壞 血 酸（ascorbic acid,AA）cTnl（ab47003）、FLK-1（ab2349），SOX2（ab97959） 及 OCT（ab19857） 抗 體（ 購(gòu) 自Abcam 公 司 ），ERK1/2、p-ERK1/2、Akt、p-Akt及PD98059（購(gòu)自Cell Signaling Technology），GAPDH抗體（購(gòu)自碧云天生物公司），IME-Ⅱ倒置相差顯微鏡（購(gòu)自日本Olympus公司），Nikon數(shù)碼相機(jī)和MCV-16BSU超凈工作臺(tái)（購(gòu)自日本Sanyo公司），高速離心機(jī)3～18 k（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司），PCR儀（購(gòu)自德國(guó) Biometra公司）（PCR Stepone plus）。

1.3 MSN納米粒子的合成

MSN和熒光包被MSN的制備參考文獻(xiàn)[9-10]，基于兩步法微調(diào)后制備而成，首先將12 μl APTES加入到5.5 mg TRITC和3 ml無(wú)水乙醇的溶液中，隨后在惰性氣體中攪拌2 h。然后將TRITC-APTES溶液加入2.5 ml TEOS，避光攪拌12 h。取另1個(gè)容器，將0.5 g CTAB溶于240 ml超純水與1.75 ml NaOH（2 mol/L）的溶液中，并在50℃劇烈攪拌。待CTAB溶液的溫度穩(wěn)定后，加入含有TEOS和TRITC-APTES的乙醇溶液，50℃避光攪拌24 h。過(guò)濾樣品并用甲醇洗滌。為了去除顆粒的孔中表面活性劑，將850 mg顆粒分散在90 ml甲醇和5 ml氫氯酸（12.1 mol/L）的溶液中并回流24 h。然后將顆粒過(guò)濾，用甲醇充分洗滌，并在室溫下干燥。MSN的合成則是省略上述第一步。

1.4 MSN特性

采用光譜儀（Shimadzu UV-2450）測(cè)定紫外-可見吸收光譜。通過(guò)粒度分析儀系統(tǒng)（90 Plus,Brookhaven Instruments）測(cè)量MSN的流體動(dòng)力學(xué)尺寸分布特征和ζ電位。在200 kV的加速電壓通過(guò)JEOL模型JEM-2010透射電子顯微鏡得到TEM圖像。為制備TEM樣品，將MSN溶液滴分散在碳涂覆的300目銅格柵（Carbon Type-B,Ted Pella,Inc）上，將乙酸鈾酰溶液（2%，10 μl）滴加到網(wǎng)格上進(jìn)行陰性染色。

1.5 TMSN與TMSN-AA的合成

將TRITC負(fù)載二氧化硅納米顆粒（TRITC mesoporous silica nanoparticles,TMSN）（50 mg）和 AA（5 mg）加入5 ml超純水中并攪拌24 h，然后將混合物以7 000 r/min離心10 min，棄去上清液。通過(guò)使用紫外-可見分光光度法，比較原始溶液和上清液的吸光度值，以確定裝載在TMSNs內(nèi)的AA的量。用超純水超聲處理載有藥物的TMSN并洗滌2次以除去吸附在表面而不是孔內(nèi)的AA。TMSN納米載體的負(fù)載效率為：1 mg/ml，TMSN可負(fù)載0.12 mg/ml的AA。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

將人胚胎干細(xì)胞（hESCs）常規(guī)培養(yǎng)于DMEM（Gibco）培養(yǎng)基與Ham's F-12培養(yǎng)基1∶1混合的培養(yǎng)基中，其中含有1.2 g/L碳酸氫鈉，2.5 mmol/L L-谷氨酰胺，15 mmol/L 4-羥乙基哌嗉乙碘酸（HEPES），0.5 mmol/L丙酮酸鈉，0.1 mmol/L非必需氨基酸，0.1 mmol/L 2-巰基乙醇，4 ng/ml bFGF和15%胎牛血清。將hESCs細(xì)胞接種在沒(méi)有飼養(yǎng)層細(xì)胞的超低培養(yǎng)板中，37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 RNA提取與RT-PCR檢測(cè)靶基因mRNA水平

以PBS處理組作為陰性對(duì)照組，TMSNs，AA和TMSN-AA分別處理hESCs細(xì)胞14 d后，使用Trizol（Invitrogen）從hESCs細(xì)胞中提取總RNA，并用分光光度計(jì)（Nano Drop 2000）。參照說(shuō)明書，使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Takara）將總RNA（2 μg）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過(guò)使用SYBR Green（TaKaRa）在ABI Prism 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中實(shí)時(shí)測(cè)定靶基因的mRNA水平。所用引物的序列見附表。

1.8 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

通過(guò)MTT測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞活力。將hESCs細(xì)胞以5 000個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，以PBS處理組為對(duì)照組，不同濃度的MSN納米顆粒和TMSN納米顆粒孵育48 h。在每個(gè)測(cè)定中，加入5 mg/ml MTT，孵育4 h。然后加入150 μl 100%二甲基亞砜（DMSO，Sigma），緩慢振蕩5 min使沉淀溶解。然后用波長(zhǎng)490 nm的酶標(biāo)儀（Bio-Rad）測(cè)量吸光度。細(xì)胞活力計(jì)算為樣品孔的吸光度與對(duì)照孔的吸光度之比，以百分?jǐn)?shù)表示，將未處理細(xì)胞的存活率指定為100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析。兩兩比較，若方差齊時(shí)，采用SNK檢驗(yàn)（Student-Newman-Keuls法）；若方差不齊時(shí)，采用Games-Howell檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot條帶由相關(guān)軟件處理后，采用Image J2x軟件對(duì)免疫印跡條帶掃描后進(jìn)行半定量分析并用同一張膜上相應(yīng)泳道的GAPDH或β-actin條帶的灰度進(jìn)行校正。用Graph Pad Prism 6軟件做圖。

2 結(jié)果

2.1 MSN的合成與特性

透射電子顯微鏡顯示制備的MSN具有均勻的粒度和高度分散的球形（見圖1A）。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)對(duì)MSN的流體動(dòng)力學(xué)尺寸分布進(jìn)行表征（見圖1B），MSN的大小分布為（94.9±8.3）nm。為觀察hESCs細(xì)胞中MSN的吸入情況，將MSN與熒光染料TRITC結(jié)合發(fā)現(xiàn)TMSNs的吸收光譜在580 nm附近達(dá)到峰值（見圖1C）。采用TMSN-AA誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)hESCs細(xì)胞（見圖1D），TMSN-AA的ζ電位值保持正電荷（+22.7）mV，并與細(xì)胞膜具有強(qiáng)烈的靜電相互作用。

2.2 TMSN進(jìn)入hESCs細(xì)胞的體外檢測(cè)結(jié)果

TRITC的熒光是橙色，與用MSN處理的細(xì)胞比較，用TMSN處理的hESCs細(xì)胞中呈橙色熒光。PBS作為陰性對(duì)照組，顯示細(xì)胞無(wú)背景熒光干擾，提示TMSN可以成功靶向進(jìn)入hESCs細(xì)胞中。見圖2。

2.3 MSN和TMSN對(duì)hESCs存活與凋亡的影響

hESCs細(xì)胞用10～200 μg/ml的不同濃度的MSN或TMSN處理48 h（見圖3A）。經(jīng)處理的hESCs細(xì)胞的細(xì)胞存活率即使在最高濃度下也保持在80%以上。與PBS處理的細(xì)胞（空白組）比較，MSN和TMSN納米顆粒處理的hESCs細(xì)胞無(wú)凋亡（見圖3B、3C）。

2.4 TMSN-AA納米復(fù)合體對(duì)hESCs向心肌細(xì)胞分化的影響

TMSN-AA納米復(fù)合體可以有效地誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，顯著下調(diào)OCT4（F=29.115，P=0.000）、SOX2（F=49.986，P=0.000）的蛋白水平以及mRNA 水平OCT4（F=42.655，F(xiàn)=0.000），SOX2（F=49.194，P=0.000），與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)上調(diào)心肌標(biāo)記基因cTnI（F=687.525，P=0.000） 和 FLK-1（F=512.688，P=0.000） 的 蛋白表達(dá)以及mRNA水平cTnI（F=560.089，P=0.000）和 FLK-1（F=106.881，P=0.000），與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，相對(duì)于單獨(dú)添加AA，由TMSN輸送的AA用于誘導(dǎo)hESCs細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞效果更為明顯，效率更高，其跳動(dòng)細(xì)胞比例和心率均優(yōu)于單獨(dú)添加AA，波動(dòng)細(xì)胞百分率（F=386.835，P=0.000），自發(fā)搏動(dòng)率（F=171.830，P=0.000）與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 MSN的形態(tài)、粒度以及3種不同MSN納米復(fù)合物的特性表征

圖2 熒光修飾的介孔二氧化硅（TMSNs）可以成功進(jìn)入hESCs細(xì)胞

2.5 TMSN-AA對(duì)hESCs心肌分化影響的菌落觀察

圖3 MSN和熒光染料四甲基羅丹明修飾的TMSN對(duì)hESCs存活與凋亡的影響

未經(jīng)誘導(dǎo)分化的hESC呈現(xiàn)緊密、并且平坦的菌落，菌落中的細(xì)胞顯示出高的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的比例（見圖5A1）。而單獨(dú)使用AA處理后的細(xì)胞，可通過(guò)囊性腔的外觀發(fā)現(xiàn)部分hESCs逐漸成熟（見圖5A2）。使用TMSN-AA處理相同時(shí)間后，在貼壁培養(yǎng)條件下，hESCs細(xì)胞中心出現(xiàn)搏動(dòng)區(qū)（見圖5A3）。免疫熒光檢測(cè)心臟特異性蛋白的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在跳動(dòng)完整的hESCs中，cTnI和α-肌動(dòng)蛋白均僅在EB的跳動(dòng)區(qū)域染色陽(yáng)性（見圖5B）。在從hESCs的搏動(dòng)區(qū)域分散的細(xì)胞中，cTnI在單細(xì)胞水平與α-actinin或α-actin共表達(dá)。此外，有組織的肌節(jié)條紋的比對(duì)模式在雙重染色的分離的收縮細(xì)胞中可見（見圖5C）。

對(duì)hESC衍生的心肌細(xì)胞的體外功能，筆者將該細(xì)胞的誘導(dǎo)作用進(jìn)行藥理學(xué)評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)隨著硝苯地平（Nifedipine）劑量的增加，細(xì)胞跳動(dòng)頻率下降。當(dāng)濃度達(dá)到10～6 mol/L時(shí)，細(xì)胞完全停止搏動(dòng)。另一方面，異丙腎上腺素（Isoprenaline）處理后，細(xì)胞則是以劑量依賴的方式提高收縮頻率（見圖5D），上述結(jié)果表明，hESCs經(jīng)TMSN-AA誘導(dǎo)后，可分化為功能性心肌細(xì)胞。

2.6 TMSN-AA納米復(fù)合物在促進(jìn)hESCs向心肌細(xì)胞分化的過(guò)程中ERK1/2信號(hào)通路的變化

圖4 hESCs細(xì)胞中TMSN遞送的抗壞血酸（AA）對(duì)其干細(xì)胞基因表達(dá)和對(duì)hESCs細(xì)胞心肌分化的影響

誘導(dǎo)后的hESCs采用TMSN-AA處理120 min后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ERK1/2信號(hào)通路被激活，其在TMSN-AA刺激后1 min即被激活，并持續(xù)到120 min（F=321.805，P=0.000），見圖6A。采用1.5×106mol/L ERK1/2抑制劑PD98059處理后，觀察hESCs細(xì)胞的搏動(dòng)頻率以及α-MHC的表達(dá)水平，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=444.847，P=0.000），見圖6B、6C。在本過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Akt信號(hào)通路并未參與，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=27.338，P=0.000），見圖6D，其中處理組α-MHC的mRNA水平升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而10～5 mol/L渥曼青霉素處理并不影響其表達(dá)進(jìn)行20 d的處理而不變，與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.071，P=0.0689），見圖 6E、6F。

圖5 功能性心肌細(xì)胞與hESCs的分化

圖6 TMSN-AA誘導(dǎo)hESCs心肌分化時(shí)ERK1/2的信號(hào)通路的變化

3 討論

心肌細(xì)胞死亡是心肌梗死后導(dǎo)致心力衰竭和死亡的關(guān)鍵因素。心臟是終末分化的器官，再生能力十分有限，成體心臟自身無(wú)法有效補(bǔ)充心梗缺血區(qū)死亡的心肌細(xì)胞，而死亡的心肌細(xì)胞最終由纖維疤痕取代導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生、發(fā)展[11]。迄今為止，治療慢性心力衰竭的唯一方法就是心臟移植，但是由于供體數(shù)量的限制以及高昂的治療費(fèi)用，因而受到極大的限制[12]。因此，迫切需要發(fā)展治療心肌梗死及繼發(fā)心力衰竭的新方法，以降低心肌梗死和心力衰竭的死亡率。

hESCs是來(lái)源于早期人胚胎未分化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞的特異性干細(xì)胞，其具有在體外通過(guò)某些特定的因子誘導(dǎo)，無(wú)限增殖和分化成任何細(xì)胞的潛能，被認(rèn)為是全能干細(xì)胞，對(duì)各類細(xì)胞的再生起重要作用[13]。根據(jù)其分化的不同細(xì)胞類型，目前已經(jīng)有大量的研究用于組織修復(fù)等。到目前為止，可通過(guò)細(xì)胞移植治療的疾病范圍已經(jīng)包括糖尿病、創(chuàng)傷性脊髓損傷、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、心臟病或視聽受損等[11，14]。但由于受分化程序繁瑣且時(shí)間較長(zhǎng)，分化效率低等限制，雖然已經(jīng)證實(shí)AA、DMSO及5-Aza-2'-脫氧胞苷等具有誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的能力，但該藥物的誘導(dǎo)效率很大程度上取決于細(xì)胞攝取量以及擬胚體的形成，所以在應(yīng)用方面長(zhǎng)期裹足不前[7，15]。而干細(xì)胞，抑或是癌細(xì)胞表面所具有的獨(dú)特的外排泵可以使細(xì)胞免受藥物或其他物質(zhì)刺激，進(jìn)而產(chǎn)生多藥耐藥能力等[3，16]，因此，如何精準(zhǔn)的實(shí)現(xiàn)藥物呈遞，促進(jìn)細(xì)胞攝取，進(jìn)而誘導(dǎo)其分化成為了近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[17]。

作為納米載體，具有獨(dú)特和可調(diào)的介孔結(jié)構(gòu)，高負(fù)載能力和無(wú)與倫比的生物相容性的MSN已經(jīng)被用作廣泛的治療劑的有效藥物遞送平臺(tái)，用于治療各種類型的疾病。在本研究中，MSNs通過(guò)溶膠-凝膠法制備，并優(yōu)化已發(fā)表的程序[18]。沒(méi)有熒光染料TRITC的MSN沒(méi)有吸收峰。在合成中，TEOS用作二氧化硅前體，在表面活性劑的表面凝結(jié)，并在生成的膠束表面周圍形成二氧化硅壁，使MSN帶正電荷（+27 mV）和具有陽(yáng)性電荷的TMSN電荷（+26.2 mV）。研究發(fā)現(xiàn)熒光修飾的介孔二氧化硅（TMSNs）可以成功地進(jìn)入hESCs，并且以熒光修飾的介孔二氧化硅（TMSNs）為載體輸送抗壞血酸（AA）可以誘導(dǎo)hESCs的分化。更為重要的是，通過(guò)熒光修飾的介孔二氧化硅（TMSNs）輸送的AA可以有效地誘導(dǎo)hESCs分化為心肌細(xì)胞，上調(diào)心肌標(biāo)記基因cTnI和FLK-1，同時(shí)下調(diào)多能性標(biāo)志物OCT4及SOX2[19]。此外，相對(duì)于單獨(dú)添加AA，由熒光修飾的介孔二氧化硅（TMSNs）輸送的AA用于誘導(dǎo)人ES細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞更有效，上述結(jié)果證實(shí)TMSN-AA可以靶向誘導(dǎo)hESCs的分化。

ERK1/2信號(hào)通路在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中具有多種重要的生物學(xué)作用[20]。有報(bào)道稱，在小鼠中植入前胚體中，F(xiàn)GF/ERK1/2突進(jìn)參與內(nèi)胚層發(fā)育[21]，在脊椎動(dòng)物中，實(shí)驗(yàn)表明，ERK1/2信號(hào)通路傳導(dǎo)對(duì)神經(jīng)外胚層和中內(nèi)胚層分化[22-23]。在本研究中，TMSN-AA可以激活ERK1/2促進(jìn)hESCs的心肌分化，加入其特異性抑制劑PD98059后，ERK1/2信號(hào)通路被抑制，hESCs心肌分化下降，進(jìn)一步證實(shí)ERK1/2信號(hào)通路在hESCs心肌分化過(guò)程中的作用。除此之外，本研究還研究另一信號(hào)通路PI3K/Akt在hESCs心肌分化過(guò)程中作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TMSN-AA誘導(dǎo)期分化過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)通路為參與這一過(guò)程，進(jìn)一步使用抑制劑渥曼青霉素也證實(shí)了這一結(jié)論。筆者的研究結(jié)果表明，ERK1/2信號(hào)通路對(duì)TMSN-AA誘導(dǎo)hESCs心肌分化起著重要作用，而PI3K/Akt信號(hào)通路在這一過(guò)程中并未被激活。

綜上所述，筆者成功構(gòu)建TMSN-AA納米載體，并證實(shí)其可以通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)hESCs的心肌分化。為今后化學(xué)藥物與納米材料聯(lián)合使用構(gòu)建心肌藥物遞送系統(tǒng)提供的很好的參考與思路，為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中進(jìn)一步研究體外誘導(dǎo)細(xì)胞分化乃至于實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用提供很好的研究基礎(chǔ)。