李大剛，李輝宗，康樂(lè)

（1.山東省臨沂市人民醫(yī)院東醫(yī)療區(qū) 呼吸內(nèi)科，山東 臨沂 276000；2.山東省蒙陰縣中醫(yī)院 內(nèi)三科，山東 蒙陰 276200）

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）作為肺癌常見(jiàn)類型之一，約占原發(fā)性肺癌的20%左右[1]，由于該腫瘤侵襲力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速且易早期轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者臨床確診時(shí)已處于中晚期，盡管該腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療敏感，但治愈率較低，多數(shù)患者治療后仍會(huì)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，5年生存率低于10%[2]。因此，積極探討影響SCLC高侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。Vav3作為原癌基因Vav家族重要成員，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)[3]，與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞黏附、凋亡、遷移、侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)SCLC組織中Vav3表達(dá)，探討其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響，并利用小分子RNA干擾（small RNA interference,siRNA）技術(shù)抑制人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞株，觀察其對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般研究

1.1.1 臨床資料 選取2012年2月-2016年3月在臨沂市人民醫(yī)院東醫(yī)療區(qū)治療且臨床資料完整的SCLC患者87例，均經(jīng)支氣管鏡、穿刺或手術(shù)獲取病理標(biāo)本并明確診斷為單純性SCLC，術(shù)前均未接受放化療。其中，男性46例，女性41例；年齡33～79歲，平均（59.2±12.4）歲；臨床分期：局限期43例，廣泛期44例；61例具有吸煙史，40例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。所有患者出院后均進(jìn)行隨訪，方式包括門診和電話，隨訪截止2017年3月31日，未出現(xiàn)失訪病例，存活36例，死亡51例。另留取同期因肺外傷行手術(shù)治療的正常肺組織50例作為對(duì)照組，均排除惡性腫瘤患者。其中，男性29例，女性21例；年齡31～78歲，平均（60.1±12.9）歲。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，兔抗人Vav3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Vav3、內(nèi)參引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，siRNA-Vav3、siRNA-對(duì)照序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）購(gòu)自美國(guó)ABI公司，恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自常州邁科諾儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織中Vav3蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取SCLC和對(duì)照組組織，甲醛固定、石蠟包埋、切片，厚度約4 μm，用二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度酒精脫水，用3% 過(guò)氧化氫H2O2浸泡10 min以消除內(nèi)源過(guò)氧化物酶影響，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）沖洗3次，置于枸櫞酸（pH 6.0）液中煮沸15 min，用1%血清工作液封閉，室溫孵育25 min。加入一抗兔抗人Vav3多克隆抗體（稀釋比例1∶500），4℃過(guò)夜孵育，PBS沖洗3次，加入二抗，室溫下靜置120 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后封片，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淡黃色或黃褐色顆粒狀或斑塊狀染色作為陽(yáng)性，采用半定量法積分法進(jìn)行結(jié)果判定[5]：①染色強(qiáng)度：0分：無(wú)染色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色；②陽(yáng)性細(xì)胞比例：0分：無(wú)著色細(xì)胞；1分：陽(yáng)性細(xì)胞比例≤10%；2分：10%＜陽(yáng)性細(xì)胞比例＜25%；3分：陽(yáng)性細(xì)胞比例25%～50%；4分：陽(yáng)性細(xì)胞比例≥50%；③將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分之和作為最終結(jié)果，陰性：≤2分，陽(yáng)性：＞2分。所有結(jié)果判定均采用盲法由2位病理科主治醫(yī)師單獨(dú)完成，出現(xiàn)結(jié)果不一致時(shí)由病理科主任醫(yī)師作出最終判定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 取人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞株，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在含5%二氧化碳CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[6]。消化后，傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞完成實(shí)驗(yàn)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并分組。①siRNA-Vav3組，轉(zhuǎn)染Vav3干擾序列：正向5'-GGAAGGGTTCAGAACCTTA-3'，反向5'-GAAGATCTCTATGACTGTG-3'；②siRNA-對(duì)照序列組，轉(zhuǎn)染對(duì)照序列：正向5'-UUCUCCGAACGUGUCA CGUTT-3'，反向5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；③空白組，不作任何處理。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Vav3基因表達(dá) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒獲得總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，以A260/A280在1.80～2.30為合格。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA[7]，以cDNA作為模板進(jìn)行PCR。引物序列：VAV3正向5'-TGAAGGCAGAGGAAGCACAT-3'，反向5'-GCATAG GAACCACAAGCAAGT-3'；β-Actin 正向 5'-GTCATTC CAAATATGAGATGCGT-3'，反向 5'-GCATTACATAAT TTACACGAAAGCA-3'[7]。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min，94℃變性30s，58℃退火30s，74℃延伸30s，連續(xù)循環(huán)38次。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法計(jì)算各組細(xì)胞中Vav3基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h細(xì)胞，按2×105個(gè)/ml接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)90%以上時(shí)，用200μl槍頭于垂直于孔板劃直線，且寬度相同，將散落細(xì)胞用PBS液去除，分別于0和24h時(shí)觀察細(xì)胞遷移情況并拍照，用Image J圖像分析軟件分析劃痕愈合率=（1～24h時(shí)劃痕面積/0h時(shí)劃痕面積）×100%。

1.2.5 Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞遷移和侵襲能力 ①遷移能力檢測(cè)：取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h細(xì)胞，胰酶消化后，接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml，取200μl加入到Transwell小室上室，將600μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)液加入小室下室，培養(yǎng)12h，多聚甲醛固定15min，結(jié)晶紫染色15min，將散落細(xì)胞用棉簽輕輕去除，PBS沖洗后，顯微鏡觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。②侵襲能力檢測(cè)：將50μg Matrigel膠平鋪于Transwell小室上室，風(fēng)干后以備檢。其余步驟同遷移能力檢測(cè)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCLC和對(duì)照組組織中Vav3蛋白表達(dá)比較

SCLC組織中Vav3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為81.6%（71/87），對(duì)照組為14.0%（8/50），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.739，P=0.000），SCLC組織中Vav3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組組織中Vav3蛋白表達(dá)（免疫組化×200或400）

2.2 SCLC組織中Vav3蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

SCLC組織中Vav3蛋白表達(dá)與性別、年齡、腫瘤位置及吸煙無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生存狀態(tài)有關(guān)（P=0.024、0.016和0.014）。見(jiàn)表1。

2.3 SCLC組織中Vav3蛋白表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響

Vav3蛋白陽(yáng)性表達(dá)組患者平均生存時(shí)間23.14個(gè)月，總生存率為35.21%；而Vav3蛋白陰性表達(dá)組則為44.89個(gè)月，總生存率為68.75%。Vav3蛋白陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.280，P=0.012），Vav3蛋白陽(yáng)性表達(dá)組患者平均生存時(shí)間低于Vav3蛋白陰性表達(dá)組。見(jiàn)圖2。

2.4 各組細(xì)胞中Vav3基因表達(dá)比較

siRNA-Vav3組、siRNA-對(duì)照序列組和空白組細(xì)胞中Vav3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.17±0.23）、（2.19±0.14）和（2.25±0.16），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.751，P=0.000），siRNA-Vav3組細(xì)胞中Vav3 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于siRNA-對(duì)照序列組和空白組，見(jiàn)圖3。

表1 SCLC組織中Vav3蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 例（%）

圖2 SCLC組織中Vav3蛋白表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響

圖3 各組細(xì)胞中Vav3基因表達(dá)

2.5 各組細(xì)胞遷移能力比較

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-Vav3組、siRNA-對(duì)照序列組和空白組細(xì)胞24 h后劃痕愈合率分別為（12.80±1.54）%、（29.19±3.23）% 和（27.74±1.50）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=98.539，P=0.000），siRNA-Vav3組細(xì)胞24 h后劃痕愈合率低于siRNA-對(duì)照序列組和空白組，見(jiàn)圖4。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-Vav3組、siRNA-對(duì)照序列組和空白組遷移細(xì)胞數(shù)分別為（87.01±7.68）、（108.54±6.47）和（111.13±11.71）個(gè)，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.261，P=0.000），siRNA-Vav3組遷移細(xì)胞數(shù)低于siRNA-對(duì)照序列組和空白組，見(jiàn)圖5。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞愈合能力

2.6 各組細(xì)胞侵襲能力比較

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-Vav3組、siRNA-對(duì)照序列組和空白組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（97.18±9.11）、（125.52±9.66）和（130.00±9.98）個(gè)，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.664，P=0.000），siRNA-Vav3組侵襲細(xì)胞數(shù)低于siRNA-對(duì)照序列組和空白組，見(jiàn)圖6。

圖5 各組細(xì)胞遷移能力比較 （結(jié)晶紫×200）

圖6 各組細(xì)胞侵襲能力比較 （結(jié)晶紫×200）

3 討論

SCLC作為肺癌常見(jiàn)類型，近年來(lái)發(fā)病率不斷升高，臨床上主要以全身化療聯(lián)合放療、手術(shù)作為主要治療方式，但治療效果有限[8]。雖然SCLC細(xì)胞對(duì)化療敏感，但極易產(chǎn)生多藥耐藥，出現(xiàn)復(fù)發(fā)[9]。有研究指出[10]，SCLC細(xì)胞高侵襲、轉(zhuǎn)移能力是影響患者治療效果及預(yù)后的主要因素。因此，積極探討影響SCLC高侵襲、高轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)機(jī)制，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。Vav3是癌基因家族重要成員，可通過(guò)促進(jìn)三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）酶活化而參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用[11]，同時(shí)亦可通過(guò)影響Rho家族分子間相互作用而對(duì)細(xì)胞極性、黏附能力等產(chǎn)生影響[12]?，F(xiàn)已證明，Vav3在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)[13]，在調(diào)控腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲等過(guò)程中發(fā)揮重要關(guān)鍵性作用[14]。本研究結(jié)果顯示，Vav3蛋白在SCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，說(shuō)明Vav3蛋白在SCLC組織中呈高表達(dá)，提示Vav3蛋白可能參與SCLC發(fā)生過(guò)程。進(jìn)一步分析與臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，SCLC組織中Vav3蛋白表達(dá)與臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生存狀態(tài)有關(guān)（P＜0.05），廣泛期、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和死亡患者組織中Vav3蛋白表達(dá)量增加，提示Vav3蛋白可能參與SCLC侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，且與患者預(yù)后有關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，SCLC組織中Vav3蛋白陽(yáng)性表達(dá)組患者總生存率低于Vav3蛋白陰性表達(dá)組，進(jìn)一步表明SCLC組織中Vav3蛋白表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)。

為進(jìn)一步探討Vav3在SCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，本研究利用siRNA技術(shù)特異性沉默H446細(xì)胞中Vav3基因，結(jié)果顯示，siRNA-Vav3組細(xì)胞中Vav3 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于siRNA-對(duì)照序列組和空白組，說(shuō)明H446細(xì)胞中Vav3基因被成功抑制。研究表明[15]，Vav3及其反向信號(hào)分子可通過(guò)參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而在腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本研究劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，siRNA-Vav3組劃痕愈合率和遷移細(xì)胞數(shù)均低于siRNA-對(duì)照序列組和空白組，說(shuō)明特異性沉默H446細(xì)胞中Vav3基因可有效抑制細(xì)胞遷移能力，同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，siRNA-Vav3組侵襲細(xì)胞數(shù)低于siRNA-對(duì)照序列組和空白組，說(shuō)明特異性沉默H446細(xì)胞中Vav3基因可有效抑制細(xì)胞侵襲能力，本結(jié)果表明，Vav3基因在小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞遷移、侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，Vav3蛋白在SCLC組織中呈高表達(dá)，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，特異性沉默SCLC細(xì)胞中Vav3基因可抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，有望為SCLC綜合防治提供新的靶點(diǎn)。