胥丹，姜淮蕪，蒲羽

（1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川綿陽(yáng)404醫(yī)院腹部外科，四川 綿陽(yáng) 621000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是目前臨床常見惡性腫瘤之一，世界上癌癥相關(guān)死亡的第二大腫瘤類型，世界每年肝癌新發(fā)病例52.3萬(wàn)例[1]。目前治療手段有限，主要以放療、化療和分子靶向藥物治療為主，5年存活率＜5%，預(yù)后不佳[2-3]。HCC發(fā)生與發(fā)展與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的策略成為近年來(lái)晚期HCC治療重點(diǎn)。PDCD5和Caspase-3蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶，調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的中心環(huán)節(jié)，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[4-5]。本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染靶向PDCD5-Caspase-3融合基因過(guò)表達(dá)作用于人肝癌細(xì)胞HepG2，觀察PDCD5和Caspase-3蛋白對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響，初步探討其作為肝癌治療潛在靶點(diǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

人HepG-2肝癌細(xì)胞（購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司），胰蛋白酶、DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基和胎牛血清（購(gòu)自美國(guó)Gibco公司），青霉素和鏈霉素（購(gòu)自上海生物工程有限公司），CCK-8檢測(cè)試劑盒、APCAnnexin V細(xì)胞凋亡試劑盒和蛋白提取試劑盒（購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），鼠抗人單克隆PDCD5抗體、鼠抗人單克隆Caspase-3抗體（購(gòu)自美國(guó)Acom公司），辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗鼠IgG（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司），兔抗鼠β-actin單克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司）。蛋白電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。PDCD5-Caspase-3融合基因合成及轉(zhuǎn)染用慢病毒均由上海吉?jiǎng)P基因公司提供。

1.2 PDCD5-Caspase-3融合基因構(gòu)建及慢病毒包裝

利用PubMed基因數(shù)據(jù)庫(kù)查詢PDCD5和Caspase-3基因CDS序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)融合基因序列，PCR擴(kuò)增PDCD5-Caspase-3融合基因片段，將目的融合基因克隆到慢病毒GV358中，引物序列：正向5'-CCATCAGAGAGAAAACCGAAC-3'，反向 5'-CCTCT TATAGTCCACTTATGTC-3'，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次，72℃延伸5 min，最后取適量菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，測(cè)序結(jié)果與與目標(biāo)序列完全一致。抽提Ubi-PDCD5-Caspase-3-SV40-EGFP質(zhì)粒，采用二代自失活型慢病毒包裝系統(tǒng)完成包裝過(guò)程，將攜帶PDCD5-Caspase-3融合基因的GV358載體質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，高速離心收集含慢病毒顆粒的239T細(xì)胞上清液，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HepG-2肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HepG-2肝癌細(xì)胞株活性強(qiáng)，增殖旺盛，2～3 d即可傳代1次，待培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，離心收集，含10%DMEM培養(yǎng)基重懸，按照3×105個(gè)/ml種植24孔板中，每孔400 μl。按照吉?jiǎng)P公司推薦的HepG-2肝癌細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)為100，設(shè)置3組：①實(shí)驗(yàn)組（5 μg/ml Polybrene+50 μl Ubi-PDCD5-Caspase-3-SV40-EGFP病毒上清液）；②對(duì)照組（5 μg/ml Polybrene+50 μl陰性對(duì)照病毒上清液）；③空白組（不加病毒上清液）；37℃培養(yǎng)箱中孵育12 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。由于質(zhì)粒中含有EGFP基因，本研究利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染效率。

1.4 Western blot檢測(cè)PDCD5和Caspase-3蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，離心收集5×105個(gè)各組細(xì)胞，PBS清洗3次，蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定樣品中總蛋白濃度，蛋白變性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜80V 2 h，5%脫脂奶粉封閉lh，剪膜，加入1∶300稀釋鼠抗人單克隆PDCD5抗體（一抗）和1∶500鼠抗人單克隆Caspase-3抗體（一抗），4℃孵育過(guò)夜，加入1∶400 HRP標(biāo)記二抗室溫孵育30 min，1∶1 000稀釋?duì)?Actin作為內(nèi)參，在ECL顯色系統(tǒng)中顯色定影，AlphaEase FC軟件分析顯色的雜交條帶。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

HepG-2肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，以1×105個(gè)/ml種植96孔板，每孔100 μl，每組9孔，在轉(zhuǎn)染24、48和72 h，各組均分別選取3孔檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，每孔加入CCK-8試劑10 μl，37℃，5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)各孔吸光度（A）值，波長(zhǎng)450 nm，參比波長(zhǎng)為630 nm。每孔復(fù)測(cè)3次，取結(jié)果平均值行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按照APC-Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書操作，細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，PBS清洗2遍，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，每管收集2×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin VAPC和5 μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較，方差齊性用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染12 h后，PBS清洗細(xì)胞2遍，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到98.7%（見圖1A），熒光顯微鏡下觀察到滿視野綠色熒光分布（見圖1B），表明Ubi-PDCD5-Caspase-3-SV40-EGFP慢病毒能高效轉(zhuǎn)染HepG-2肝癌細(xì)胞，能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PDCD5和Caspase-3蛋白表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染72 h后，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組PDCD5蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.427±0.094）、（0.171±0.059）和（0.202±0.077），各組PDCD5蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.100，P=0.036），實(shí)驗(yàn)組PDCD5蛋白水平較對(duì)照組或空白組均增加，對(duì)照組與空白組無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.625±0.132）、（0.151±0.089）和（0.139±0.067），各組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.969，P=0.017），實(shí)驗(yàn)組Caspase-3蛋白水平較對(duì)照組或空白組均增加，對(duì)照組與空白組無(wú)差異（P＞0.05）。見圖2。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

圖2 各組PDCD5和Caspase-3蛋白表達(dá)

2.3 細(xì)胞增殖變化

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組和空白組降低，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組OD值分別 為（1.19±0.23）、（2.18±0.51） 和（2.33±0.48），各組OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.509，P=0.044），實(shí)驗(yàn)組OD值較對(duì)照組或空白組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)照組與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 細(xì)胞凋亡情況

轉(zhuǎn)染72 h后，空白組細(xì)胞凋亡率為（2.33±1.02）%，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為（2.94±0.81）%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為（37.7±5.65）%，各組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.728，P=0.0184），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組或空白組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)照組與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 3。

圖3 細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

近10年，全世界范圍內(nèi)HCC發(fā)病率上升。若HCC早期診斷（腫瘤直徑＜2 cm），予以手術(shù)切除，則生存率可達(dá)到70%[6]。然而，臨床HCC患者就診時(shí)已屬癌癥晚期，治療效果較差，無(wú)法單靠手術(shù)切除治愈。與其他腫瘤類型發(fā)病機(jī)制類似，HCC發(fā)生發(fā)展與癌基因活化，抑癌基因失活，細(xì)胞增殖/細(xì)胞凋亡失平衡有關(guān)[7]。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，由一系列促凋亡基因和抑凋亡基因調(diào)控，而腫瘤細(xì)胞抑凋亡基因活性增強(qiáng)，促凋亡基因活性降低，細(xì)胞趨向于永生化[8]。

在促凋亡蛋白家族中，PDCD5蛋白是我國(guó)率先報(bào)道的一種重要的促細(xì)胞凋亡相關(guān)因子[9]。已有報(bào)道表明，PDCD5在腫瘤組織中表達(dá)減少，通過(guò)與P53信號(hào)通路作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)程，有可能作為相關(guān)腫瘤診斷與治療靶點(diǎn)[10-11]。研究表明，與正常組織比較，肝癌細(xì)胞中PDCD5 mRNA和蛋白質(zhì)水平均較低，PDCD5表達(dá)與乙肝病毒感染、腫瘤數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝癌患者存活時(shí)間密切相關(guān)，并可作為HCC患者總生存期和無(wú)病生存率的預(yù)測(cè)因子[12-13]。另外，PDCD5基因低表達(dá)常誘導(dǎo)其他多種促凋亡因子表達(dá)，維持肝癌細(xì)胞的化療藥物敏感性，增加抗腫瘤治療效果[14]。另外，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路傳導(dǎo)依賴于下游效應(yīng)蛋白-Caspase蛋白激活，活化Caspase在細(xì)胞中能夠切割400多種功能蛋白底物，如Lamins、信號(hào)分子如蛋白激酶、骨架蛋白、DNA修復(fù)酶等，該重要蛋白質(zhì)的降解和核酸酶的激活最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-3蛋白是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分?；钚訡aspase-3可作用于一些其他Caspase成員，并降解相應(yīng)的胞漿胞核底物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如果Caspase-3活性受到抑制，則出現(xiàn)細(xì)胞凋亡異常，從而引起腫瘤產(chǎn)生[15]。研究表明，肝癌細(xì)胞HepG2中Caspase-3蛋白活性及蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均顯著低于正常肝細(xì)胞[16]。HUA等[17]證實(shí)，HCC分級(jí)越高，癌細(xì)胞分化越差，Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越低，提示Caspase-3蛋白表達(dá)水平與HCC惡性程度呈負(fù)相關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中，基于Caspase-3和PDCD5蛋白在肝癌治療與預(yù)后中重要作用，筆者利用基因重組技術(shù)設(shè)計(jì)一種能同時(shí)靶向過(guò)表達(dá)上述兩種蛋白的融合基因。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而實(shí)現(xiàn)目的基因長(zhǎng)期且穩(wěn)定的表達(dá)，目前己成為表達(dá)外源基因常用載體形式之一。另外，常用的轉(zhuǎn)染劑，如脂質(zhì)體和質(zhì)粒，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，且化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑通常存在較明顯的細(xì)胞毒性[18]。相比較而言，慢病毒轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞類型相關(guān)，一般可達(dá)50%～80%[19]。筆者利用人類免疫缺陷型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的慢病毒GV358載體，轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ubi-PDCD5-Caspase-3-SV40-EGFP慢病毒轉(zhuǎn)染效率高達(dá)98.9%，推測(cè)這種高轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞類型密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞活性強(qiáng)，其轉(zhuǎn)染率隨之升高。成功轉(zhuǎn)染后，蛋白水平證實(shí)轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組PDCD5和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。其次，筆者進(jìn)一步觀察抑制PDCD5和Caspase-3蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)于人HepG2肝癌細(xì)胞增殖和凋亡率的影響，結(jié)果證實(shí)，與未轉(zhuǎn)染和陰性序列轉(zhuǎn)染組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速度放緩，表明生長(zhǎng)狀態(tài)受到影響。同時(shí)，轉(zhuǎn)染72 h后，實(shí)驗(yàn)組HepG2肝癌細(xì)胞早期凋亡率增加，且晚期細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞壞死數(shù)量均增加。

綜上所述，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染靶向PDCD5-Caspase-3融合基因過(guò)表達(dá)作用于人肝癌細(xì)胞系HepG2，可增強(qiáng)PDCD5和Caspase-3蛋白表達(dá)，降低HepG2肝癌細(xì)胞增殖速度，促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡，因此有望作為肝癌治療新型潛在靶點(diǎn)。