韓小亞 周文柏 劉建兵 龍偉 張麗娜 張玢

宮頸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在全球婦女惡性腫瘤死亡率中居第四位。在全球范圍內(nèi),每年新發(fā)宮頸癌約529 800例，在發(fā)展中國(guó)家每年會(huì)導(dǎo)致275 100例死亡[1]。人類乳頭瘤病毒高危型感染會(huì)激活致癌基因、使腫瘤抑制基因失活[2]。此外，吸煙、多個(gè)性伴侶以及衛(wèi)生狀況差都會(huì)增加宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3]。隨著宮頸癌疫苗的開(kāi)發(fā)，宮頸癌篩查技術(shù)的普遍應(yīng)用，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率明顯下降[4，5]，但是其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，生物節(jié)律維持睡眠-清醒周期、行為、代謝、激素分泌等生物行為以適當(dāng)?shù)墓?jié)奏在體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)。目前臨床病例和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，生物節(jié)律關(guān)鍵基因有clock（circadian locomotor output cycles kaput）、per1（period 1）、per2（period 2）、per3（period 3）、cry1（cryptochrome 1）、cry2（cryptochrome 2）、bmal1（brain and muscle ARN-t like protein 1）、npas2（neuronal PAS domain protein 2）、rev-erb α（retinoic acid receptor-related orphan receptor α）、dec1（differentially expressed in chondrocyte 1）、dec 2（differentially expressed in chondrocyte 2）和 ckiε（casein kinase I ε）、cki δ（casein kinase I δ）、tim（timeless）共計(jì)14種，當(dāng)體內(nèi)生物節(jié)律發(fā)生紊亂，生物鐘基因可以通過(guò)調(diào)控鐘控基因的表達(dá)，直接或間接參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。目前僅見(jiàn)生物節(jié)律tim基因在宮頸癌中的研究報(bào)道[7]。本研究期望通過(guò)在宮頸癌組織中生物節(jié)律正負(fù)反饋調(diào)控基因的表達(dá)差異的研究，探討生物節(jié)律基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年11月～2017年8月宮頸鱗癌術(shù)后新鮮標(biāo)本30例，及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織作為對(duì)照組（均經(jīng)病理證實(shí)）。宮頸鱗癌患者均為初次接受手術(shù)，術(shù)前未接受放化療，年齡39～58歲，平均47.6歲。新鮮組織標(biāo)本置于1.5ml離心管中加入1ml Trizol充分混勻，室溫靜置5min后放入-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 clock、per、cry、bmal、tim 和內(nèi)標(biāo)β-actin引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3 組織總RNA制備 在冰上用組織勻漿器研磨至糊狀，加入0.2ml的氯仿，劇烈搖晃后靜置2min，12 000r/min離心10min后取上清，加入0.5ml異丙醇后靜置10min，12 000r/min離心10min后取沉淀，加入1ml的75%乙醇漂洗后干燥，溶于DEPC水中，定量總RNA濃度。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 參照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A）說(shuō)明書(shū)操作將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA樣本-20℃保存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件 95℃預(yù)變性1min，95℃變性 30s，62℃退火 30s，72℃延伸 1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。所有PCR反應(yīng)均在ABI 7500 PCR儀上進(jìn)行。

1.6 RT-PCR產(chǎn)物的檢測(cè) 采用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增合成的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。利用UVP凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物條帶進(jìn)行掃描，對(duì)電泳條帶灰度進(jìn)行分析，將目標(biāo)條帶灰度與擴(kuò)增的β-actin條帶灰度的比值表示為各mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。mRNA相對(duì)表達(dá)水平組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 生物節(jié)律基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌中生物節(jié)律基因clock的變化 宮頸癌組生物節(jié)律基因clock的表達(dá)為0.41±0.04，對(duì)照組為1.00±0.00，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.65，P＜0.05）。

2.2 宮頸癌中生物節(jié)律基因bmal的變化 宮頸癌組及癌旁對(duì)照組的生物節(jié)律基因bmal的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.86±0.14、1.00±0.00，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 宮頸癌中生物節(jié)律基因per的變化 宮頸癌組及癌旁對(duì)照組的生物節(jié)律基因per1的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.12±0.03、1.00±0.00，表達(dá)極顯著下調(diào)（t=7.22，P＜0.001）；per2基因表達(dá)分別為0.21±0.04、1.00±0.00，表達(dá)極顯著下調(diào)（t=6.89，P＜0.001）。

2.4 宮頸癌中生物節(jié)律基因cry的變化 宮頸癌組及癌旁對(duì)照組的生物節(jié)律基因cry1的表達(dá)為0.12±0.03及1.00±0.00，宮頸癌組顯著下調(diào)（t=2.98，P＜0.05），而 cry2的表達(dá)為 0.14±0.04與對(duì)照組相比極顯著下調(diào)（t=6.98，P＜0.001）。

2.5 宮頸癌中生物節(jié)律基因tim的變化 宮頸癌組及癌旁對(duì)照組的生物節(jié)律基因tim的表達(dá)分別為2.9±0.067及1.00±0.00，宮頸癌組顯著上調(diào)（t=8.52，P＜0.001）。各生物節(jié)律基因的表達(dá)見(jiàn)圖1。

圖1 生物節(jié)律基因在宮頸癌中的表達(dá)情況

3 討論

在過(guò)去的幾十年間，現(xiàn)行的宮頸癌篩查已經(jīng)大大降低了宮頸癌的死亡率，通過(guò)篩查能早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療，現(xiàn)在甚至發(fā)病之前就可對(duì)其進(jìn)行預(yù)防。然而隨著基于生物節(jié)律基因的研究，興起了一種新型的個(gè)體化治療模式。研究生物節(jié)律基因與宮頸癌之間的關(guān)聯(lián)性，可探尋宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，找到更好的篩查方法及個(gè)性化診療方案。本研究結(jié)果表明，在人類宮頸癌發(fā)生過(guò)程中生物節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄水平存在明顯差異。

眾所周知，生物節(jié)律基因是由clock基因和bmal1基因通過(guò) PAS（Per-Arnt-Sim）區(qū)域形成異二聚體，與受生物節(jié)律調(diào)節(jié)基因(包括per和cry)上游的E-box結(jié)合，啟動(dòng)節(jié)律性基因轉(zhuǎn)錄；而per與cry表達(dá)升高后，形成的異二聚體可與clock和bmal1結(jié)合，反饋性抑制其轉(zhuǎn)錄功能。此外，由per和tim基因編碼的蛋白磷酸化后形成二聚體，在核內(nèi)能夠延緩轉(zhuǎn)錄過(guò)程。因此，clock/bmal1二聚體激活的per和cry基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程被per/tim二聚體抑制，但隨著兩個(gè)二聚體蛋白之間相互作用的加強(qiáng)，per/tim二聚體出現(xiàn)轉(zhuǎn)變，負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，轉(zhuǎn)錄過(guò)程被重新激活[8]。此外，tim與per1-3結(jié)合后能進(jìn)入細(xì)胞核，抑制clock基因的活性，降低clock基因表達(dá)，從而終止生物鐘周期[9]。

clock基因作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的脊椎動(dòng)物生物節(jié)律基因[10]，是目前研究最多的基因。諸多研究表明，多種腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展均與clock基因密切相關(guān)。clock基因與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[11]，在大腸癌、甲狀腺癌組織中clock基因mRNA呈高表達(dá)[12,13]。本研究在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)了與其他腫瘤相反的clock基因的表達(dá)情況，clock基因的表達(dá)在宮頸癌組織較其配對(duì)的癌旁正常組織呈顯著下調(diào)，提示clock基因在正常組織中具有一定的生理作用。

目前生物節(jié)律基因per1和 per2的研究表明，其通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)參與細(xì)胞周期的調(diào)控，并且per1和 per2的表達(dá)異常與多種腫瘤密切相關(guān)。在口腔鱗狀細(xì)胞癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、胃癌以及乳腺癌組織中，per1和per2的表達(dá)水平均降低[14～16]。本研究中，宮頸癌組織中的per1和per2同樣表現(xiàn)出顯著下調(diào)的情況，表明存在潛在的抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致癌變。per1和per2表達(dá)下調(diào)也可能引起基質(zhì)金屬蛋白水解酶-2表達(dá)上調(diào)，同時(shí)加大層黏連蛋白受體-1在細(xì)胞膜上的分布，從而增強(qiáng)腫瘤的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移能力。

cry基因作為生物節(jié)律基因家族中最重要的成員之一，cry1與cry2均是負(fù)向反饋調(diào)節(jié)因子。其中cry1可以不依賴于per或兩者復(fù)合物，直接與clock或bmal1或clock/bmal1復(fù)合物起作用抑制轉(zhuǎn)錄，因此目前有學(xué)者認(rèn)為cry1抑制活性強(qiáng)于任何per蛋白[17]。在妊娠期糖尿病、胰腺癌和結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)cry基因與這些疾病發(fā)生并無(wú)相關(guān)性[18,19]。而本研究結(jié)果卻顯示cry1與cry2基因表達(dá)都發(fā)生明顯下調(diào)，這可能導(dǎo)致了晝夜節(jié)律的紊亂，從而誘發(fā)宮頸癌的發(fā)生。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中多個(gè)生物節(jié)律關(guān)鍵基因的表達(dá)發(fā)生了變化，clock、per1、per2、cry1和cry2均表達(dá)下調(diào)，這會(huì)直接影響異二聚體所形成的相對(duì)數(shù)量，從而使節(jié)律相位發(fā)生異常，造成生物節(jié)律系統(tǒng)紊亂，引發(fā)宮頸癌的發(fā)生。而tim基因表達(dá)上調(diào)，應(yīng)當(dāng)是機(jī)體對(duì)紊亂的生物節(jié)律系統(tǒng)的負(fù)向調(diào)控。

綜上所述，通過(guò)對(duì)宮頸癌中生物節(jié)律基因的初步研究，可知宮頸癌中的確存在著復(fù)雜的生物節(jié)律基因表達(dá)異常的情況，表明clock、per1、per2、cry1、cry2和tim均可能參與了宮頸癌的發(fā)生過(guò)程。然而，更多的機(jī)制研究將有助于進(jìn)一步闡明各基因在宮頸癌發(fā)生中的確切作用，并有助于靶向治療策略。