向安萍 馮華 滕淑靜 宋旭日

迷迭香[1]（Rosmarinus officinalis L.）是一種唇形科迷迭香屬植物，全草可入藥，味辛性溫，具有健胃、安神的功效。早在2000多年前的歐洲，迷迭香被用來增強(qiáng)記憶力、改善語言障礙；飲用迷迭香茶可提神醒腦，提高注意力。本實(shí)驗(yàn)擬研究迷迭香提取物對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的昆明種小鼠180只，雌雄各半，清潔級(jí)，平均體質(zhì)量（20±3）g。

1.1.2 藥物與主要試劑 迷迭香由平江香草公司提供，采用水蒸氣蒸餾和溶劑萃取法[2]制備迷迭香精油、迷迭香水溶性提取物和迷迭香脂溶性提取物；氫溴酸東莨菪堿注射液（上海禾豐制藥有限公司），規(guī)格為1ml: 0.3mg；鹽酸吡硫醇片（腦復(fù)新，上海新亞藥業(yè)有限公司）；生理鹽水（貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司）。

1.1.3 儀器 DT- 200跳臺(tái)自動(dòng)測試儀（上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司）、ZH-500x型小鼠避暗儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；BW- MYM103型Y迷宮（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為3組，每組60只，準(zhǔn)備分別用于跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)和Y迷宮實(shí)驗(yàn)。每組60只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性藥組及迷迭香精油組、水溶性提取物組和脂溶性提取物組（n=10）。

1.2.2 給藥 各組在實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行6d的適應(yīng)性訓(xùn)練，第7天給藥：空白對照組和模型組給予等體積的生理鹽水，陽性藥組灌胃腦復(fù)新100mg/kg，試藥組分別灌胃迷迭香精油、水溶性提取物和脂溶性提取物200mg/kg，連續(xù)14d；末次給藥后1h除空白對照組腹腔注射等量的生理鹽水，其余各試驗(yàn)組均腹腔注射東莨菪堿3mg/kg[3]，20min后進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 將小鼠先放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)3min，然后通36V交流電。動(dòng)物在受到電擊時(shí)的正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)從而躲避傷害性刺激。但多數(shù)動(dòng)物可能再次或多次跳下平臺(tái)到銅柵上，受電擊后又快速跳回平臺(tái)。記錄小鼠受到電擊的次數(shù)即為錯(cuò)誤次數(shù)，如此訓(xùn)練5min，作為學(xué)習(xí)成績。24h后再進(jìn)行測試，記錄小鼠第一次跳下平臺(tái)的時(shí)間即為潛伏期和5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)。

1.2.4 避暗實(shí)驗(yàn) 將小鼠放入避暗儀的明室，明暗室間的圓洞打開，讓小鼠自由穿梭于明暗室適應(yīng)3min；測試時(shí)暗室通電（36V），小鼠背對洞口放入明室，進(jìn)入暗室受到電擊，正常反應(yīng)為返回明室，反復(fù)訓(xùn)練5min。24h后再測試，記錄進(jìn)入暗室潛伏期和5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)。

1.2.5 Y迷宮實(shí)驗(yàn) Y迷宮有3個(gè)支臂和一個(gè)連接區(qū)，每臂均可通電源，不通電的支臂為安全區(qū)，其他兩支臂則通電為非安全區(qū)，安全區(qū)與非安全區(qū)可隨機(jī)改變。將小鼠放于起步區(qū)（未通電）適應(yīng)3min，然后通電變換安全區(qū)；每當(dāng)小鼠到達(dá)安全區(qū)30s后再隨機(jī)改變安全區(qū)的位置，轉(zhuǎn)變5s后非安全區(qū)底部通電，刺激小鼠足底而驅(qū)使其跑向安全臂。小鼠在10s內(nèi)從非安全區(qū)一次性跑向安全區(qū)即被判為正確，否則均判為錯(cuò)誤。以10次測試中正確的次數(shù)作為小鼠學(xué)習(xí)記憶的成績。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，樣本均數(shù)比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對小鼠跳臺(tái)學(xué)習(xí)記憶能力的影響 如表1所示，模型組的跳臺(tái)學(xué)習(xí)成績和記憶成績較空白對照組明顯下降，說明建成了記憶障礙模型。與模型組比較，陽性藥組、迷迭香精油組、水溶性提取物組和脂溶性提取物組使小鼠跳臺(tái)學(xué)習(xí)成績和記憶成績明顯提高（P＜0.01）。

表1 迷迭香提取物對小鼠跳臺(tái)成績的影響（±s，n=10）

注：與空白對照組比，*P＜0.01，#P＜0.05；與模型組比，**P＜0.01

組別 學(xué)習(xí)成績（5min錯(cuò)誤次數(shù)）記憶成績潛伏期（s） 5min錯(cuò)誤次數(shù)空白對照組 3.0±0.3 236.9±6.3 2.1±0.2模型組 4.6±0.4* 187.8±5.2* 3.0±0.4#陽性藥組 2.9±0.3** 240.4±7.9** 1.9±0.2**迷迭香提取物精油組 3.1±0.2** 235.7±10.0** 1.7±0.2**水溶性組 2.7±0.3** 256.2±8.9** 1.2±0.2**脂溶性組 2.9±0.4** 253.9±7.6** 1.3±0.2**

2.2 對小鼠避暗學(xué)習(xí)記憶能力的影響 模型組的避暗實(shí)驗(yàn)潛伏期較空白對照組縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、迷迭香精油組、水溶性提取物組和脂溶性提取物組的避暗潛伏期延長，錯(cuò)誤次數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表 2。

2.3 對小鼠Y迷宮學(xué)習(xí)記憶能力的影響 如表2所示，模型組的Y迷宮實(shí)驗(yàn)正確次數(shù)較空白對照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、迷迭香精油組、水溶性提取物組和脂溶性提取物組Y迷宮10次實(shí)驗(yàn)的正確次數(shù)均有提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 迷迭香提取物對小鼠避暗和Y迷宮成績的影響（±s，n=10）

表2 迷迭香提取物對小鼠避暗和Y迷宮成績的影響（±s，n=10）

注：與空白對照組比*P＜0.01；與模型組比，**P＜0.01

組別避暗實(shí)驗(yàn) Y迷宮（10次實(shí)驗(yàn)的正確次數(shù)）潛伏期（s） 5min錯(cuò)誤次數(shù)空白對照組 234.0±6.2 1.0±0.3 7.8±0.4模型組 183.4±5.3* 2.4±0.4* 4.2±0.4*陽性藥組 213.4±8.0** 1.0±0.3** 6.8±0.4**迷迭香提取物精油組 206.8±2.0** 1.2±0.2** 7.0±0.5**水溶性組 221.4±2.7** 0.6±0.2** 7.4±0.8**脂溶性組 219.4±3.9** 0.8±0.2** 7.2±0.5**

3 討論

學(xué)習(xí)記憶是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高級(jí)思維活動(dòng)，是由乙酰膽堿（Acetylcholine,Ach）、5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine,5-HT）、γ-氨 基 丁 酸（γ-ami nobutyric acid ,GABA）等多種神經(jīng)遞質(zhì)參與的復(fù)雜的神經(jīng)生理活動(dòng)[3]。Ach作為中樞膽堿能神經(jīng)末梢釋放的重要化學(xué)遞質(zhì)，通過與膽堿受體結(jié)合，興奮膽堿能系統(tǒng)，調(diào)節(jié)第一級(jí)記憶向第二級(jí)記憶的轉(zhuǎn)移過程，是促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)遞質(zhì)。東莨菪堿是M膽堿受體阻斷藥，通過阻斷Ach與M受體的結(jié)合，影響乙酰膽堿介導(dǎo)的記憶功能。本實(shí)驗(yàn)用東莨菪堿建立記憶障礙模型，研究迷迭香提取物對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，結(jié)果顯示：東莨菪堿記憶障礙模型構(gòu)建成功，迷迭香精油組、水溶性提取物組和脂溶性提取物組均可改善記憶障礙模型小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。

Ach的生物合成以膽堿和乙酰輔酶A為原料，在膽堿乙?；福–holine acetyltransferase, ChAT）的催化下合成。Ach在乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AchE）的作用下分解為膽堿和乙酸而失活。ChAT和AchE共同作用調(diào)節(jié)著Ach含量的動(dòng)態(tài)平衡。東莨菪堿所致記憶障礙模型小鼠腦組織的Ach含量降低、AchE活性增高、ChAT活性降低，而降低AchE活性、增強(qiáng)ChAT活性、增加腦內(nèi)Ach含量可提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[4，5]。Ach作為神經(jīng)遞質(zhì)儲(chǔ)存在膽堿能神經(jīng)末梢突觸的囊泡內(nèi)，神經(jīng)沖動(dòng)產(chǎn)生時(shí)釋放到突觸間隙以發(fā)揮作用。但是，Ach的釋放需要突觸素（synaptophysin，SYP）及其他囊泡蛋白的調(diào)節(jié)。SYP是一種突觸囊泡鈣結(jié)合蛋白，通過與Ca2+結(jié)合、促使囊泡與突觸前膜融合并開啟融合孔，引起囊泡內(nèi)Ca2+依賴性神經(jīng)遞質(zhì)如Ach的釋放[6]。研究顯示，若突觸素表達(dá)減少或缺失，Ach不能釋放，導(dǎo)致突觸信息傳遞障礙，引起記憶力下降[7]。因此，迷迭香提取物提高東莨菪堿所致記憶障礙模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制是增加Ach含量還是調(diào)節(jié)Ach的釋放還有待進(jìn)一步研究。

另外，迷迭香精油、水溶性提取物、脂溶性提取物均含有多種成分，其中迷迭香提取物油溶性有效成分主要為鼠尾草酸和水溶性有效成分主要為迷迭香酸。研究表明[8，9]，鼠尾草酸和迷迭香酸均有抗氧化作用，可抑制活性氧（reactive oxygen species,ROS）的產(chǎn)生，顯著提高衰老小鼠機(jī)體抗氧化酶活性，降低機(jī)體的氧化負(fù)荷，減輕過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生，有效延緩衰老?？梢?，迷迭香提取物對學(xué)習(xí)記憶能力的影響是某一活性成分的獨(dú)立效應(yīng)還是多種成分的聯(lián)合效應(yīng)，是單一作用機(jī)制還是多種作用機(jī)制，還有待實(shí)驗(yàn)研究論證。