李連鵬 戴偉 李楨 王尚文 張桓

羊水栓塞（amniotic fluid embolism，AFE）是由于羊水進(jìn)入母體血循環(huán)引起的一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，臨床以突發(fā)性低血壓、低氧血癥及凝血功能障礙為主，AFE是一種發(fā)病率低，但是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡的重要原因，死亡率高達(dá)60%以上，是極其兇險(xiǎn)且不可預(yù)料的產(chǎn)科并發(fā)癥，是孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一[1～3]。但查閱文獻(xiàn)和在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐工作中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入母體循環(huán)的羊水量至今無(wú)法計(jì)算，且多量羊水進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后發(fā)展變化規(guī)律不明確，故我們通過(guò)給母體注射不同劑量的自體羊水成分，將進(jìn)入母體的羊水量進(jìn)行限制，復(fù)制不同劑量的大鼠AFE模型和多量羊水入體的不同時(shí)間點(diǎn)AFE模型，并通過(guò)常規(guī)法醫(yī)學(xué)方法檢測(cè)和驗(yàn)證，來(lái)研究AFE大鼠模型的發(fā)展變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取體重（395±30）g，孕齡20d左右的健康孕晚期SD大鼠80只(昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心和湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)，均為精選滿足實(shí)驗(yàn)要求者。

分組：①健康孕晚期SD大鼠40只，隨機(jī)分成不同劑量的4組，即注入自體羊水1.25ml/kg組（低劑量組）8只、2.5ml/kg組（中劑量組）8只、4ml/kg組（大劑量組）8只以及注入所能采集到的最多無(wú)污染清亮的自體羊水組（約3ml/只，即極大劑量組）8只的大鼠模型和正常組大鼠8只做子宮次全切、下腔靜脈緩慢注射生理鹽水2ml/只后縫合；觀察60min后處殺。②健康孕晚期SD大鼠40只，隨機(jī)分成不同時(shí)間點(diǎn)的4組和正常組，后實(shí)驗(yàn)組均注入4ml/kg羊水。實(shí)驗(yàn)分組：分別為注入羊水后30min組8只、3h組8只、6h組8只、24h組8只和24h正常對(duì)照組8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備實(shí)驗(yàn)用羊水 羊水來(lái)自每只動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天行子宮次全切，剪破離體子宮壁、羊膜腔后收集肉眼觀測(cè)清亮的羊水。

1.2.2 制備羊水栓塞動(dòng)物模型 術(shù)前禁食6h，飲水不受限。10%水合氯醛腹腔注射麻醉動(dòng)物，麻醉生效后固定于手術(shù)臺(tái)上剪去腹部體毛，使用含有效碘0.5%的碘伏消毒液消毒術(shù)區(qū)皮膚；使用消毒手術(shù)器械做腹部切口和子宮次全切術(shù)；使用無(wú)菌紗布覆蓋切口，并立即使用無(wú)菌生理鹽水漂洗離體子宮，擦干后行子宮內(nèi)羊水收集，體外取羊水時(shí)速度要快，盡量避免胎糞浸染羊水，確保收集的羊水清亮；后按規(guī)定劑量從下腔靜脈緩慢注入自體羊水，實(shí)驗(yàn)中注入羊水時(shí)速度盡量緩慢以貼近于臨床實(shí)際；注射完成后縫合腹壁各層組織并碘伏消毒。使用消毒過(guò)的鼠籠、墊料分籠單獨(dú)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)大鼠（以防止麻醉清醒早的大鼠利用體重壓迫麻醉清醒晚的大鼠）。上述各組到時(shí)間后拉頸處死動(dòng)物，取肺、腦、肝組織，使用10%福爾馬林溶液固定后行石蠟包埋、采用相同組織的連續(xù)3張切片（厚度5μm），行常規(guī)組織HE染色，對(duì)無(wú)法檢出明確羊水成分組織的其余兩張切片，行抗角蛋白16染色法、APM雙重組化染色法染色，后行病理學(xué)檢查。正常對(duì)照組子宮次全切后從下腔靜脈緩慢注入生理鹽水后關(guān)腹。

1.2.3 查找羊水成分 由兩名從事十年以上法醫(yī)病理學(xué)鑒定的專家在顯微鏡下對(duì)大鼠肺、肝、腦組織病理切片進(jìn)行羊水成分（鱗狀上皮細(xì)胞、毳毛、胎糞、粘液和羊水結(jié)晶等成分）的查找，如未發(fā)現(xiàn)羊水成分則行抗角蛋白16染色法、APM雙重組化染色法染色復(fù)查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)定量資料（如：每張固定大小切片中檢出血管中有羊水成分的血管數(shù)量/該張切片中血管總數(shù)量）用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗(yàn)。P＜0.05（或P＜0.01）為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型組孕鼠的臨床表現(xiàn) 對(duì)照組從腹主靜脈緩慢注入生理鹽水后出現(xiàn)短暫性呼吸加快，后恢復(fù)。AFE各組均有心率和呼吸頻率的改變：麻醉蘇醒后各組大鼠的心率均加快，且心率加快的持續(xù)時(shí)間隨著羊水劑量的增大而增大。麻醉蘇醒后各組大鼠的呼吸頻率均有加快，且呼吸頻率加快的持續(xù)時(shí)間隨著羊水劑量的增大而增大。在不同劑量的4組中，大劑量組和極大劑量組的心率和呼吸頻率加快時(shí)間是同步的，且各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從麻醉蘇醒至實(shí)驗(yàn)結(jié)束均未恢復(fù)。在不同時(shí)間點(diǎn)的4組中，6h組和24h組持續(xù)時(shí)間分別為（4±1.75）h、（4±2.5）h，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AFE各組均伴有局部抽搐、小便失禁等，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有按無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)操作和術(shù)后單只分鼠籠單獨(dú)飼養(yǎng)的各組大鼠在處死前均無(wú)死亡。

2.2 染色結(jié)果

2.2.1 肺梗死和出血情況 極大劑量組3只(37.5%)檢見(jiàn)小灶狀的肺梗死、肺出血，大劑量組1只（12.5%）檢見(jiàn)小灶狀的肺梗死、肺出血；其余各組實(shí)驗(yàn)大鼠肺、腦、肝中僅肺組織可以檢出羊水成分。在檢見(jiàn)小灶狀肺梗死的實(shí)驗(yàn)大鼠的腦組織和肝組織中檢見(jiàn)毳毛（見(jiàn)圖1）、角化上皮、粘液和血栓等成分，分析認(rèn)為毳毛和角化上皮等成分系肺梗死后進(jìn)入肺靜脈通過(guò)體循環(huán)進(jìn)入。

2.2.2 低劑量組存在未檢出羊水成分的情況 不同劑量的4組中，低劑量組3只（37.5%）肺組織中未檢出羊水成分。未檢出羊水成分實(shí)驗(yàn)大鼠的肺、腦、肝組織均經(jīng)過(guò)APM染色和抗角蛋白16染色亦未發(fā)現(xiàn)羊水成分。其余各組均檢出羊水成分。

2.2.3 各實(shí)驗(yàn)組的相似性變化 各實(shí)驗(yàn)組均有不同程度的肺水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨劑量增大而加重；不同劑量的4組中，大劑量組7只（87.5%）和極大劑量組8只（100%）的肺組織有重度肺水腫（見(jiàn)圖2）、肺出血及炎性反應(yīng)。各實(shí)驗(yàn)組的肺組織均可見(jiàn)不同程度的肺萎陷、肺泡腔變窄所致的肺泡大小不一（見(jiàn)圖3），間質(zhì)血管擴(kuò)張，出血，血管及支氣管周圍可見(jiàn)大量以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨劑量增大而加重。各實(shí)驗(yàn)組均可見(jiàn)腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞腫脹或固縮的缺氧性病變和肝細(xì)胞水樣變性的改變。各實(shí)驗(yàn)組均可見(jiàn)溶血樣改變，部分管腔內(nèi)可見(jiàn)腫脹的紅細(xì)胞（見(jiàn)圖4）。

2.2.4 羊水成分的重吸收和分解情況 不同時(shí)間點(diǎn)的4組中，24h組未檢見(jiàn)羊水成分中的毳毛、胎糞和粘液，同時(shí)該切片APM染色法能在支氣管中檢見(jiàn)分泌的粘液成分；檢見(jiàn)的角化上皮成分的量和大小均較前3組輕微，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度略重。

2.2.5 HE染色下肺動(dòng)脈分支及肺泡壁毛細(xì)血管內(nèi)檢見(jiàn)紅色條索狀的角化上皮成分、淡紅色粘液、黃褐色的胎糞及紅色的微血栓，以及核藍(lán)色、胞漿紅色的合體樣細(xì)胞等羊水成分，均為非特異性著色（見(jiàn)圖 2）。

2.2.6 APM染色法下肺動(dòng)脈分支及肺泡壁毛細(xì)血管內(nèi)可見(jiàn)呈條索狀、桃紅色的鱗狀上皮細(xì)胞和毳毛等角化上皮成分以及藍(lán)色的酸性粘液和桃紅色的微血栓，肺上皮細(xì)胞的胞漿呈淡染的淺藍(lán)或無(wú)色，血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿幾乎不著色（見(jiàn)圖5）。

2.2.7 Resist keratin-16免疫組化染色法下肺動(dòng)脈分支及肺泡壁毛細(xì)血管內(nèi)可見(jiàn)角化上皮呈褐色（見(jiàn)圖6）。

圖1 腦干HE染色，×200，示血管內(nèi)檢見(jiàn)毳毛成分

圖2 肺HE染色，×400，示重度肺水腫

圖3 肺HE染色，×200，血管空虛、炎性細(xì)胞和肺泡大小不一

圖4 前額皮質(zhì)HE染色，×400，血管內(nèi)溶血

3 討論

一直認(rèn)為，AFE的發(fā)生機(jī)理是由于羊水和羊水中的有形成分進(jìn)入孕產(chǎn)婦血循環(huán)，但Clark等[4，5]觀察到胎兒的鱗狀上皮細(xì)胞進(jìn)入孕婦血循環(huán)而不引起AFE癥狀，認(rèn)為正常羊水進(jìn)入孕產(chǎn)婦血循環(huán)可能并無(wú)危害。Hankins等[6]發(fā)現(xiàn)在所有輸注羊水的樣本中肺循環(huán)系統(tǒng)有升壓反應(yīng)，且升壓反應(yīng)程度在輸注羊水原液、被過(guò)濾的羊水、被過(guò)濾且被煮沸的羊水的標(biāo)本是相同的。用羊水原液灌流離體肺[7]，也未產(chǎn)生由于機(jī)械性栓塞而引起的肺動(dòng)脈高壓和肺水腫，并且在鏡下檢查發(fā)現(xiàn)有胎兒毳毛及上皮細(xì)胞沉著在血管內(nèi)，無(wú)明顯的血管痙攣發(fā)生；而用不含羊水有形成分的羊水栓塞樣血漿灌流離體肺，雖無(wú)機(jī)械性栓塞現(xiàn)象，但能立即使肺動(dòng)脈壓升高，導(dǎo)致肺水腫產(chǎn)生。胡國(guó)英[8]等證實(shí)大鼠羊水入血后可引起中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及一系列病理變化，由此引起肺損傷及臨床癥狀，但并無(wú)致死性動(dòng)物。有報(bào)道稱AFE病例尸檢未在孕產(chǎn)婦血循環(huán)中發(fā)現(xiàn)胎兒鱗狀上皮碎屑，認(rèn)為鱗狀上皮存在與否對(duì)AFE而言并非主要[9]。這些結(jié)果直接表明羊水栓塞致肺循環(huán)病變的原因不完全是羊水中有形成分引起的機(jī)械性栓塞，而羊水入血后引起一些血管活性物質(zhì)的釋放導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的病理生理改變，或者是極少數(shù)的人對(duì)羊水中的抗原成分產(chǎn)生特殊的反應(yīng)，使孕產(chǎn)婦出現(xiàn)嚴(yán)重的血液動(dòng)力學(xué)變化，包括左心功能衰竭、肺血管損傷、凝血功能異常，這些是引發(fā)AFE的重要因素[10，11]。羊水進(jìn)入孕產(chǎn)婦血循環(huán)是胎盤生理屏障存在破口之故，在正常妊娠中胎兒血細(xì)胞、胎兒上皮細(xì)胞或滋養(yǎng)層細(xì)胞在孕產(chǎn)婦血中可以見(jiàn)到。大多數(shù)情況下這些物質(zhì)不引起臨床癥狀，但在某些孕婦中這種胎兒相關(guān)成分則可引起一系列嚴(yán)重的病理生理反應(yīng)，極像在過(guò)敏性休克及感染性休克中所見(jiàn)[11～15]?，F(xiàn)有部分觀點(diǎn)認(rèn)為AFE發(fā)病機(jī)制可能是無(wú)抗體參加的過(guò)敏樣反應(yīng)，在此反應(yīng)中異體物質(zhì)引起肥大細(xì)胞脫顆粒，異常的花生四烯酸代謝產(chǎn)物，包括白三烯、前列腺素、血栓素等進(jìn)入孕產(chǎn)婦血循環(huán)引起一系列嚴(yán)重病理生理變化[12,13]。已有研究證實(shí)，這些遞質(zhì)和凝血機(jī)制紊亂直接相關(guān)?？梢哉f(shuō)，羊水栓塞綜合征事實(shí)上是一種類過(guò)敏反應(yīng)綜合征。隨著對(duì)變應(yīng)原疾病發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，目前已從單純測(cè)定組胺、白三烯等介質(zhì)延伸至檢測(cè)參與過(guò)敏性炎癥重要的生物活性物質(zhì)，以評(píng)估炎癥的程度和判斷病情。具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)上述觀點(diǎn)，只有在羊水量極大的情況下，甚至是可以收集到的全部自體羊水成分通過(guò)下腔靜脈等進(jìn)入右心室，才會(huì)有部分實(shí)驗(yàn)大鼠通過(guò)栓塞引起肺組織小灶狀梗死，羊水成分才能通過(guò)梗死灶進(jìn)入肺靜脈，且進(jìn)入體循環(huán)的羊水量尚不足以引起臟器的梗死。但自體羊水大部分進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)在臨床中是難以發(fā)生的，而且我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)羊水進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后存在吸收和分解的情況。且本次實(shí)驗(yàn)的大鼠均未發(fā)生死亡，推測(cè)可能原因是致死性AFE發(fā)生率較低，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量少，難以成功復(fù)制致死性AFE模型；在實(shí)驗(yàn)中，收集的羊水保持清亮狀態(tài)，胎糞浸染少，致敏性強(qiáng)的胎糞成分少，也可能是無(wú)致死性AFE的原因之一；大鼠耐受性較強(qiáng)，對(duì)有創(chuàng)性手術(shù)和實(shí)驗(yàn)抵御能力強(qiáng)，且無(wú)菌操作和大鼠飼養(yǎng)條件中環(huán)境的消毒是保證大鼠存活的必要條件；實(shí)驗(yàn)觀測(cè)時(shí)間短，尚未達(dá)到溶血、出血等因素導(dǎo)致的多器官功能衰竭死亡，也可能是實(shí)驗(yàn)中無(wú)致死性AFE的原因之一。從上述情況推測(cè)少量羊水成分進(jìn)入孕鼠血循環(huán)后，單一因羊水成分中有形物質(zhì)機(jī)械性栓塞尚不足以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，且羊水成分存在重吸收和分解的情況。我們認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中羊水成分的檢出率應(yīng)為100%，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示低劑量組3只孕鼠( 37.5% )肺組織中未檢出羊水成分，在黃神姣等[16]的實(shí)驗(yàn)中，也證實(shí)通過(guò)病理學(xué)來(lái)診斷羊水栓塞可能是不可靠的。

圖5 肺APM染色，×400，示重度肺水腫

圖6 肺抗角蛋白16染色，×400，示重度肺水腫

綜上所述，羊水成分進(jìn)入孕鼠血循環(huán)后，單一因羊水成分中有形物質(zhì)機(jī)械性栓塞尚不足以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，且羊水成分存在重吸收和分解的情況。羊水栓塞綜合征事實(shí)上是存在個(gè)體差異和種屬差異，是一種類過(guò)敏反應(yīng)綜合征。隨著對(duì)變應(yīng)原疾病發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，目前已從單純測(cè)定組胺、白三烯等介質(zhì)延伸至檢測(cè)參與過(guò)敏性炎癥重要的生物活性物質(zhì)，以評(píng)估炎癥的程度和判斷病情，而類過(guò)敏反應(yīng)綜合征的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。