王 宇,任 剛,王寅寅,蘇 飛,唐小敏,葉緒芳

人類腸道病毒(huamn enteroviruses,HEVs)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬的成員,HEVs是人類普遍的致病病毒之一,目前根據(jù)病毒株的基因特征及生物學(xué)遺傳特性分析已知腸道病毒超過100多種型別,并可分成腸道病毒A、B、C和D 4組[1-2].腸道病毒主要包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus,PV)、柯薩奇病毒(coxsackievirus,CV)、?？刹《?echovirus,ECHO)以及新型腸道病毒(newer enteroviruses),HEVs的主要傳染源為病人或無癥狀帶毒者,其可引起多種疾病,特別是引起兒童的皰疹性咽峽炎、手足口病、急性出血性結(jié)膜炎、心肌炎和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等亦成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[3].

急性弛緩性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)系統(tǒng)監(jiān)測對象主要針對15歲以下兒童出現(xiàn)急性弛緩性麻痹癥狀的病例,是全球消除脊髓灰質(zhì)炎(脊灰)和維持無脊灰狀態(tài)的重要工作組成,但伴隨著全球野脊灰病毒的逐漸消滅由非脊灰腸道病毒(non-polio enterovirus,NPEV)引起的麻痹病例引起人們重視.1999年Oberste等[4]提出了基于腸道病毒VP1區(qū)序列的分子生物學(xué)定型方法,加速了對非脊灰腸道病毒分型及基因特征的研究工作.貴州省自1994年后未發(fā)現(xiàn)本土脊灰野病毒病例[5],但每年都會(huì)在AFP病例的糞便標(biāo)本中分離到大量的NPEV,為了解貴州地區(qū)NPEV毒株的血清型別特征,依據(jù)VP1區(qū)基因定型原理,本研究對2013年從貴州省AFP病例糞便標(biāo)本中分離到NPEV進(jìn)行了回顧性檢測分析,并分析CVA4的VP1基因特征,為今后對NPEV所致相關(guān)疾病的防控提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本與資料來源 腸道病毒分離物來源于貴州省2013年AFP病例監(jiān)測系統(tǒng)報(bào)告的AFP病例的糞便標(biāo)本,糞便標(biāo)本由各縣區(qū)疾病預(yù)防控制中心采集,冷藏運(yùn)送至省級(jí)脊灰實(shí)驗(yàn)室.糞便標(biāo)本均按照WHO《脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室手冊》第四版[6]的方法用RD(人橫紋肌肉瘤細(xì)胞)、L20B(轉(zhuǎn)人脊灰病毒受體的小鼠肺細(xì)胞)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及病毒分離,收集盲傳兩代后RD細(xì)胞病變而L20B不變的陽性分離物判定為非脊灰腸道病毒(NPEV),將毒株置于－20℃保存.本研究所用的腸道病毒各基因型代表株的VP1基因序列均來源于美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(NCBI).

1.2 病毒RNA提取 采用德國QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA MiniKit試劑盒,根據(jù)試劑盒的操作說明從病毒分離物中提取病毒RNA.向每管病毒RNA中加入1μL RNA酶抑制劑后－80℃保存?zhèn)溆?

1.3 VP1區(qū)RT-PCR及核苷酸序列測定 采用一步法Access QuickTMRT-PCR System試劑盒(美國Promega公司產(chǎn)品)進(jìn)行(reverse transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)擴(kuò)增NPEV毒株VP1基因.cDNA合成、RT-PCR反應(yīng)及測序中所用引物參照Oberste等[4,7]的方法進(jìn)行,PCR反應(yīng)體系:2×反應(yīng)緩沖液25μL,AMV酶混合物1μL,上下游引物各1μL,模板RNA 5μL,補(bǔ)足無RNA酶水至總體積50μL.反應(yīng)條件為45℃30 min,94℃2 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃60 s,35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,對陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后測序分析.

1.4 基因序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 采用Sequencher軟件對VP1區(qū)核苷酸進(jìn)行拼接整理,通過腸道病毒分子定型數(shù)據(jù)庫Enterovirus Genotyping Tool Version 0.1對序列定型分析;從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載腸道病毒各基因型參考毒株VP1區(qū)序列,利用MEGA7.0軟件通過鄰位相接法(neighbor joining method,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,可靠性通過1 000 bootstrap值評估.

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離與鑒定 2013年共采集235例AFP病例糞便標(biāo)本,共分離到25株腸道病毒,其中NPEV為24株,分離率約為10.2%(24/235).另外1株為PV病毒并送國家脊灰實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行型內(nèi)鑒定為PVⅡ型疫苗株,未發(fā)現(xiàn)脊灰野病毒.

2.2 NPEV的測序及分子定型 通過RT-PCR對NPEV毒株進(jìn)行擴(kuò)增定型,結(jié)果見圖1.根據(jù)Oberste等[4]提出的基于腸道病毒VP1區(qū)核苷酸同源性大于75%對病毒株進(jìn)行型別鑒定,本研究24株NPEV毒株中,有2株無法擴(kuò)增定型,另外22株共包括12個(gè)血清型,其中人類腸道病毒A組包括4個(gè)血清型6株,其中3株為CVA4,15株人類腸道病毒B組包括7個(gè)血清型,1株CVA21為人類腸道病毒C組,未分離到人類腸道病毒D組病毒.各分離株與其對應(yīng)原型株的核苷酸(nucleotide,nt)一致性在75.5%～86.8%之間、氨基酸(amino acid,aa)一致性在88.0%～96.7%之間.本次分離的NPEV毒株編號(hào)、病毒型別、與對應(yīng)原型株毒株之間的nt和aa一致性性見表1.

圖1 對NPEV毒株進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增定型Fig.1 RT-PCR amplification of NPEV strains for genotyping

表1 貴州省2013年分離到的22株NPEV的基本信息Tab.1 Basic information of 22 NPEV isolates in Guizhou Province in 2013

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 通過GenBank下載已鑒定到的腸道病毒各血清型原型株,22株NPEV貴州分離株與對應(yīng)原型株之間的親源關(guān)系見圖2,相同型別的分離株與對應(yīng)的原型株聚集在一起,但ECHO7貴州株與其原型株之間進(jìn)化相對較遠(yuǎn).

圖2 本研究中的22株NPEV與對應(yīng)原型株之間的基因進(jìn)化發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 22 strains of NPEV and their corresponding prototype strains

2.4 CVA4貴州分離株與其各亞型代表株之間VP1區(qū)序列對比分析 本研究分離到3株CVA4,分離率為12.5%(3/24).將3株CVA4貴州分離株與從GenBank中下載的CVA4原型株High point(AY421762)以及CVA4各基因型參考株VP1序列進(jìn)行平均遺傳距離分析見表2,發(fā)現(xiàn)CVA4貴州分離株序列與原型株A基因型High point之間的核苷酸平均遺傳距離較遠(yuǎn),可達(dá)18.4%;與CVA4的B基因型代表株Kenya(GQ176232.1)之間的核苷酸平均遺傳距離最大達(dá)20.6%.通過多重序列比對并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹見圖3,發(fā)現(xiàn)3株CVA4貴州分離株VP1區(qū)之間的核苷酸與氨基酸序列幾乎一致,推測可能來源于同一傳播鏈,并與CVA4的C2基亞因型聚為一支,提示CVA4貴州地方株為C2基因亞型.

表2 本次分離的CVA4與其各基因型代表株的nt和aa差異率Tab.2 Mean genetic distances of CVA4 strains with strains of different subgenotypes

圖3 本研究中分離的3株CVA4與其各基因亞型代表株基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 3 strains of CVA4 and their corresponding representative subprototype strains

3 討 論

腸道病毒是人類普遍易感且分布廣泛的致病原,隨著近年來腸道病毒導(dǎo)致的手足口病在全球的暴發(fā)流行越來越受到人們的重視[8].1999年Oberste等[4]提出了基于腸道病毒VP1區(qū)序列的分子定型方法,使得以前不能被血清學(xué)鑒定的腸道病毒得以發(fā)現(xiàn).VP1基因是主要決定腸道病毒抗原性,具有與血清型完全對應(yīng)的遺傳多樣性,基于該技術(shù)的運(yùn)用近年來國內(nèi)外多個(gè)地區(qū)相繼報(bào)道了腸道病毒的分子流行病學(xué)特征.國內(nèi)如山東省[9]和云南省[10]等,國外如印度[11]、尼日利亞[12]和巴基斯坦[13]等,而貴州地區(qū)對腸道病毒所致疾病的流行病學(xué)特征、臨床癥狀表現(xiàn)以及分子流行病學(xué)方面的研究較少,因此本研究對貴州省2013年從AFP病例標(biāo)本中分離到的NPEV進(jìn)行分型鑒定,了解貴州省腸道病毒的病原譜及分離到的CVA4的基因特征.

研究發(fā)現(xiàn),2013年貴州省AFP病例中的NPEV以 HEV-B為主,其次是 HEV-A、HEV-C組,沒有HEV-D組毒株,研究結(jié)果與陳蘇等[14]對云南省2015年的NPEV毒株鑒定結(jié)果相似,均以HEV-B組毒株為主,提示我國西南地區(qū)B組腸道病毒可能分布廣泛.本研究中各分離株與其對應(yīng)原型株的核苷酸一致性在75.5%～86.8%之間、氨基酸一致性在88.0%～96.7%之間,通過構(gòu)建進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)各分離株與對應(yīng)的原型株聚集在一起,但ECHO7貴州株與其原型株之間進(jìn)化相對較遠(yuǎn),提示ECHO7貴州株可能與原型株之間的VP1區(qū)存在較大的變異,也可能與腸道病毒B組其它毒株存在重組,值得進(jìn)一步關(guān)注研究.

目前研究證明腸道病毒中有66個(gè)血清型的病毒與人類疾病有關(guān)聯(lián)[15],但其是否與引起麻痹有關(guān)聯(lián)還待研究.但近年來人類腸道病毒中除引起手足口病的病原EV71和CVA16的研究報(bào)道較多外,CVA4可引發(fā)手足口病、皰疹性咽峽炎和急性弛緩性麻痹等疾病也引起廣泛關(guān)注[16].本研究中分離到的3株CVA4均屬于C2基因亞型,與我國陜西、吉林和云南等大多數(shù)地區(qū)對CVA4的分析類似[17],說明中國大陸CVA4均屬于C2基因亞型為優(yōu)勢基因亞型并存在共同進(jìn)化.目前CVA4盡管沒在貴州地區(qū)暴發(fā)流行,但考慮到在貴州省手足口病聚集性疫情病原譜監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)屬于非EV71、非CVA16的腸道病毒致病原最多,占32.20%[18],加之腸道病毒大多數(shù)為無癥狀感染狀態(tài),提示在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)加強(qiáng)包括CVA4等其他腸道病毒的監(jiān)測力度,進(jìn)一步完善區(qū)域性腸道病毒流行特征與規(guī)律分析,明確毒株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系與演替趨勢,對制定腸道病毒所致疾病的防控策略提供依據(jù).