穆玉姣,張白帆,李 懿,趙嘉詠,尤愛國(guó),夏勝利,黃學(xué)勇,許汴利

沙門菌是引起食源性疾病的重要病原菌,全球 每年發(fā)生食源性疾病病例高達(dá)數(shù)億人.沙門菌在自然界廣泛存在,主要是受感染的動(dòng)物,包括哺乳動(dòng)物(豬、牛、羊、馬、狗等)、家禽(豬、雞、鴨、鵝)、爬行類(龜、蛇)等.各種肉類及肉制品、禽類及禽蛋制品都可以在制作、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷售過程中被污染而引發(fā)食源性病例.我國(guó)每年約3億人因沙門菌感染人而患病,占病原菌食源性疾病總數(shù)的70%～80%[1].此外,由于抗菌藥物在臨床中的廣泛使用和畜牧業(yè)中作為促生長(zhǎng)劑的大量使用,沙門菌分離株的耐藥性在全球范圍內(nèi)逐漸上升.因此,很有必要對(duì)河南省沙門菌污染分布狀況進(jìn)行調(diào)查分析,對(duì)2011－2013年從生熟食品、廚具和動(dòng)物糞便等4 488份標(biāo)本中分離的332株沙門菌進(jìn)行了血清學(xué)和抗生素耐藥性研究,分析河南省沙門菌的流行狀況、菌型分布、危險(xiǎn)因素與耐藥等流行特征,為制定食源性疾病的防治對(duì)策和措施提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2011－2013年按照項(xiàng)目要求,在河南省周口市、濟(jì)源市、商丘市區(qū)、商丘睢縣、鄭州登封和鄭州中牟縣的菜市場(chǎng)、飯館、動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)采集生熟食品、廚具和動(dòng)物糞便等各類標(biāo)本共4 488份:其中雞糞512份、豬糞480份、生雞肉473份、生豬肉461份、熟豬肉441份、熟雞肉318份、熟鴨肉267份、生牛肉207份、熟牛肉197份、蒼蠅189份、熟菜菜板176份、生豆腐146份、鴨糞129份、水產(chǎn)品(包括淡水螺、生蝦、鱸魚腸、鱸魚內(nèi)臟、鱸魚體表、螺獅內(nèi)臟、甲魚體表、中華鱘體表、牛蛙體表、三槍魚體表、圣子體表、青蝦體表等)113份、生羊肉104份、羊糞101份、涼菜(包括涼拌腐竹、水煮花生、螺絲、涼拌黃瓜等)93份、熟羊肉81份.動(dòng)物糞便及標(biāo)本表面涂抹物使用Carry-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基采集保存,經(jīng)過亞硒酸煌綠增菌液(SBG)(36±1)℃增菌16 h、沙門菌顯色分離培養(yǎng)、系統(tǒng)生化鑒定;食品類樣本采樣要求及分離培養(yǎng)按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2011進(jìn)行;共分離出332株沙門菌.

1.2 試劑與儀器 Carry-Blair運(yùn)送培養(yǎng)、緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液購(gòu)自北京陸橋,SBG購(gòu)自美國(guó)BD公司,沙門菌科瑪嘉鑒定培養(yǎng)基為法國(guó)CHROMAgar,腸桿菌科細(xì)菌鑒定板條API20E購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司,沙門菌診斷血清購(gòu)自丹麥SSI公司,腦心浸液/M-H瓊脂及藥敏紙片為英國(guó)OXOID、藥敏紙片分配器購(gòu)自英國(guó)OXOID公司.

1.3 菌株的生化鑒定與血清分型 樣品在SBG中增菌培養(yǎng),第2 d轉(zhuǎn)沙門菌顯色培養(yǎng)基科瑪嘉培養(yǎng)基上,挑取紫色、淡紫色菌落轉(zhuǎn)種腦心浸液平板上37℃過夜培養(yǎng);使用API20E進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定.參照考夫曼-懷特沙門菌屬抗原表診斷沙門菌血清型,先做O相血清凝集分型,后用軟瓊脂(參見WHO沙門菌鑒定手冊(cè))進(jìn)行相位誘導(dǎo),再進(jìn)行H相(1/2相)血清凝集,使用生理鹽水做陰性對(duì)照.

1.4 藥敏試驗(yàn) 按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的Kirby-Bauer瓊脂法進(jìn)行[2],選用大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),通過χ2檢驗(yàn)分析藥物敏感性,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 沙門菌檢出情況 4 488份標(biāo)本共分離出332株沙門菌,分離率為7.40%(332/4488)出自18種食品及動(dòng)物糞便.其中從生雞肉中檢出的沙門菌最多79株,檢出率為16.70%(79/473);其次生豬肉檢出65株,檢出率為14.09%(65/461);雞糞檢出57株,檢出率為11.13%(57/512),豬糞檢出47株沙門菌,檢出率為9.79%(47/480).

表1 外環(huán)境中的沙門菌檢出情況Tab.1 Detection of Salmonella in the external environment

2.2 血清分型 共分離到332株沙門菌,可分為39種血清型,每年血清型的分布及種類也不相同(圖1).菌株均為常見的A～F群,分別為O∶4(B)群166株,O∶7/8(C)群39株,O∶9(D)群87株,O∶3,10/1,3,19(E)群34株,O∶11(F)群4株,O∶13(G)群1株,O∶28(M)群1株.39種血清型中最常見的血清型是腸炎沙門菌23.79%(79/332),德爾卑20.18%(67/332)、鼠傷寒10.84%(36/332)、印第安納7.22%(24/332)、4,5,12:i:-和阿貢納4.81%(16/332),這些血清型占沙門菌分離株的71.69%(238/332),見表2.

2.3 耐藥特征 對(duì)分離出的332株沙門菌進(jìn)行13種抗生素藥物敏感性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)沙門菌對(duì)三代頭孢類和喹諾酮類抗生素較敏感,對(duì)頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢他啶的耐藥率為7.53%、1.51%、1.81%;對(duì)環(huán)丙沙星和諾氟沙星的耐藥率為8.73%、8.43%;對(duì)氨芐西林、四環(huán)素和萘啶酸的耐藥率較嚴(yán)重,耐藥率分別 為 42.47%、57.53%、55.42%.但 通 過 對(duì)2011—2013年沙門菌耐藥率統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),沙門菌對(duì)頭孢噻肟、慶大霉素、頭孢吡肟、甲氧胺嘧啶、環(huán)丙沙星、鏈霉素、萘啶酸、諾氟沙星、復(fù)方新諾明的耐藥率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明不同年份的耐藥率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3).332株沙門菌中有174株(52.41%)為多重耐藥菌(表4).

圖1 2011－2013年環(huán)境中沙門菌血清分型Fig.1 The serotyping of Salmonella from environment In 2011－2013

表2 環(huán)境中沙門菌菌株宿主－血清分布情況Tab.2 Host and Serotyping of Salmonella isolate from environment

表3 藥物敏感性結(jié)果Tab.3 Results of mcrobial sensitivity test

表4 沙門菌多重耐藥結(jié)果Tab.4 Multiple drug resistance results

3 討 論

本次研究顯示生熟肉制品、動(dòng)物糞便、水產(chǎn)品及廚房用具中均有沙門菌的存在,從生雞肉和生豬肉中菌株的檢出率較高,其次是雞糞和豬糞.分離菌株的血清型分布非常廣泛,而且不同的宿主血清型的分布特征也有很大的差異.此次研究環(huán)境中所分離出的332株沙門菌可分為39種血清型,表明河南省環(huán)境中沙門菌血清型分布具有多樣性.位于第1位的血清型是腸炎沙門菌,其次是德爾卑沙門菌和鼠傷寒沙門菌,這與臨床流行病學(xué)調(diào)查基本相符[3],但與河南省腹瀉病人及生肉食品中分離的前5位沙門菌血清型略有不符[4-5].德爾卑沙門菌、鼠傷寒沙門菌和阿貢納沙門菌是從豬肉來源分離出來的沙門菌最常見血清型;而腸炎沙門菌、印第安納沙門菌和德爾卑沙門菌是雞肉中分離出沙門菌的主要血清型.這和孫吉昌[6]、王勤[7]等的研究有一定的區(qū)別,這說明即使食品種類相同,但畜禽的生長(zhǎng)環(huán)境和地域不同,其攜帶或污染的沙門菌血清型之間也存在差異,也說明沙門菌的血清型分布有一定的地域特點(diǎn).通過對(duì)宿主分析發(fā)現(xiàn),腸炎沙門菌絕大多數(shù)來自于雞宿主源(雞酮體、雞內(nèi)臟、雞糞等),而德爾卑沙門菌大多數(shù)來自于豬宿主源(豬肉和豬糞),結(jié)合國(guó)內(nèi)其它研究數(shù)據(jù)[8-10],可以看出腸炎沙門菌是污染家禽產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)血清型,而德爾卑沙門菌是生豬養(yǎng)殖及屠宰環(huán)節(jié)中的優(yōu)勢(shì)血清型,說明了廣泛流行于畜禽中沙門菌的血清型種類具有一定程度的一致性,也表明肉類食品沙門菌的污染與養(yǎng)殖場(chǎng)的衛(wèi)生狀況有很大的關(guān)聯(lián).

由于抗生素在臨床和畜牧業(yè)中的廣泛使用,細(xì)菌耐藥是近年來醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)面臨的重大問題.對(duì)環(huán)境中沙門菌耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)臨床治療沙門菌感染的傳統(tǒng)藥物氯霉素、廣譜青霉素、磺胺類和四環(huán)素類抗生素均產(chǎn)生了一定的耐藥性,對(duì)第三代頭孢類和三代喹諾酮類抗生素敏感性較強(qiáng);這可能與畜牧業(yè)中抗生素的不規(guī)范使用有關(guān),如將抗生素作為飼料添加劑以預(yù)防動(dòng)物疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)而長(zhǎng)期使用,使得抗生素以原形或代謝物形式由畜禽的糞尿排入環(huán)境,從而導(dǎo)致沙門菌對(duì)氯霉素、廣譜青霉素、磺胺類和四環(huán)素類抗生素的較高耐受.在臨床上三代頭孢類藥物主要用于兒童沙門菌感染患者,而氟喹諾酮類藥物是用于治療成人沙門菌感染[11].本次結(jié)果顯示,外環(huán)境中沙門菌對(duì)頭孢吡肟和頭孢他啶十分敏感,但對(duì)環(huán)丙沙星和諾氟沙星出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,這與陳盛杰[12]等的研究結(jié)果一致,表明隨其在臨床及畜牧業(yè)的廣泛持續(xù)使用,也產(chǎn)生一定的耐藥性,甚至多重耐藥.對(duì)此應(yīng)繼續(xù)增強(qiáng)對(duì)沙門菌污染的主動(dòng)監(jiān)測(cè)力度,加強(qiáng)對(duì)環(huán)境中沙門菌的分布研究,從而減少食物受沙門菌污染而引起的感染性疾病,并為畜牧養(yǎng)殖業(yè)抗生素的合理使用提供數(shù)據(jù)指導(dǎo).